基于罗丹明B的荧光探针“关-开”法测定硫普罗宁的含量.pdf

第 卷 第 期邵阳学院学报（自然科学版）年 月 （）文章编号：（）基于罗丹明 的荧光探针“关 开”法测定硫普罗宁的含量孙双姣，何芳，邓子璇，（邵阳学院 药学院，湖南 邵阳，；湘西南中药开发利用湖南省工程研究中心，湖南 邵阳，）摘要：目的建立一种基于碘 罗丹明 （，）体系的“关 开”荧光探针的新方法测定药物中硫普罗宁（，）含量。方法 水溶液具有荧光性质，以 为激发波长时，在 处有最大荧光强度。加入碘后，荧光强度减弱甚至消失，发生荧光猝灭。含有巯基官能团而具有较强的还原性，能将 还原为，不与 作用，将 加入到上述体系中，体系的荧光信号得以恢复。根据荧光强度的增强值（）与 的浓度呈现较好的线性关系实现对 浓度的测定。结果 浓度在 范围内与荧光强度（）有较好的线性关系，回归方程为 （），检出限为 。结论该法测定药品中 含量，操作简便可行。关键词：罗丹明 ；碘；硫普罗宁；荧光法；含量测定中图分类号：文献标志码：“”，（，；，）：（），收稿日期：基金项目：湖南省教育厅重点项目（）；省市联合基金（）作者简介：孙双姣，女，教授，博士，从事药物分析等方面的研究；：第 期孙双姣，何芳，邓子璇：基于罗丹明 的荧光探针“关 开”法测定硫普罗宁的含量 ，（），（）（）：；硫普罗宁（，）又称作为凯西莱，分子结构如图 所示，在侧链中含有巯基（），该巯基具有活性可以保护肝脏，在体内具有多种药理效应，在临床上主要用于治疗有机磷中毒 、药物性肝损伤 、早期肝硬化、慢性肝炎 、脂肪肝 等各种疾病。图 硫普罗宁分子结构 已报道的测定 的仪器分析方法主要有 、超高效液相色谱 串联质谱法 、柱前衍生 高效液相色谱荧光法 、褪色光度法 、浮选法 、金纳米荧光法 等，但这些方法有的检测灵敏度较低，分离效果较差，有的仪器设备较为复杂或昂贵，分析的成本较高，有的需要具备特殊的检测器，在实际操作过程中存在一定的限制。罗丹明 （，）属于三苯甲烷类染料，具有荧光特性，常作为分析试剂用于荧光分析。现有文献报道的氧化性物质的测定分析中已有使用过 荧光猝灭法，如测定 、铁（）、亚氯酸根 等，对于分析还原性药物的研究鲜见报道。本研究发现，在弱酸反应环境下，缔合物使得体系荧光消失，在实验体系中加入 ，分子中的官能团巯基将 还原成，溶液荧光再现，荧光强度的增加值与 的浓度存在较好的线性关系，本研究据此建立了 荧光“关 开”法测定 含量的光谱分析新方法，该法用于肠溶片中 含量的分析，具有试剂易得，选择性较好，简化便捷，分析成本较低、灵敏度较高的特点。材料与方法 仪器及试剂 电子分析天平（购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、荧光分光光度 邵阳学院学报（自然科学版）第 卷计（购自上海棱光技术有限公司）。（天津市科密欧化学试剂有限公司）、标准品（美仑生物科技有限公司）、肠溶片（上海凯宝新谊（新乡）药业有限公司；江苏亚邦爱普森药业有限公司；远大医药（中国）有限公司）、缓冲溶液（广检（广州）检测科技有限公司）、碘单质（天津市永大化学试剂有限公司）、碘化钾（国药集团）。所有试剂均为分析纯。所用的化学品均未经进一步纯化。实验用水均为去离子水。实验方法 样液的制备 标准品贮备液：分析天平准确称取 标准品，将其加水溶解后定容至 ，制成 标准品贮备液，实验时溶液稀释 倍。贮备液 ：分析天平称量 ，加水溶解后定容至 ，配制浓度为 的 贮备液。碘标准溶液 ：分析天平准确称量碘单质 （分析纯）置 容量瓶中，然后加入 的氢氧化钠 ，随后震荡半分钟，密封静置至碘完全溶解，溶液无色说明反应完全，加碘化钾固体 ，蒸馏水定容至 ，制成浓度为 碘标准溶液。随后将溶液转移至棕色细口瓶内，静置 待用，使用时稀释 倍。测定方法取 缓冲溶液 ，标准溶液适量于 容量瓶中，然后加碘液 ，反应 后再依次加入 ，加蒸馏水定容，摇匀静置 。当以 作为激发波长时，体系的荧光强度最强 。本研究的激发波长选择 。于荧光分光光度计 范围扫描体系的荧光强度，得到体系的荧光光谱，测定不同 浓度在 处的荧光强度 ，并记录实验数据。结果与讨论 荧光光谱与波长的选择图 为激发波长 时反应体系的荧光光谱图，其中，曲线 为 的荧光发光曲线，结果表明 有较强的荧光强度，且荧光发射峰位于 处；曲线 为碘液加入后的发光曲线，与曲线 相比，曲线 的荧光强度发生了猝灭，这说明碘和 之间发生了缔合，生成了 缔合物而导致罗丹明的荧光强度明显减弱；曲线 至曲线 为加入不同浓度 后碘液与 体系的荧光发射曲线，由图 可知，随着 的加入，体系的荧光再一次增强，且 加入的量越大，荧光增强幅度越大，这是因为 含有巯基官能团而具有较强的还原性，能将 还原为，不与 作用，体系的荧光信号得以恢复。条件的优化 酸度与缓冲溶液用量的选择取 标准液 ，通过加入不同体积的 的盐酸和氢氧化钠溶液，调节其 ，探究不同酸度对体系的影响 。结果表明，当 不断增强时，荧光强度增加，这是由于 分子结构中的羧基随着 浓度不断增加而导致电离程度不断增大，吸电子能力减弱，从而荧光强度增大 ；当 在 至 时处于一个比较稳定的状第 期孙双姣，何芳，邓子璇：基于罗丹明 的荧光探针“关 开”法测定硫普罗宁的含量 态；开始大于 时，碘开始发生歧化 ，二次增大，说明 在 时比较适合罗丹明和碘的缔合，也有利于 的氧化。因此本试验选择的反应介质为 为 的醋酸 醋酸钠缓冲溶液。考察缓冲溶液用量对体系荧光强度的影响。结果如图 所示，随着体积的增大，体系的荧光强度先增后降，当缓冲溶液用量为 时体系的荧光强度最大，故实验选择 为醋酸 醋酸钠缓冲溶液的用量。缓冲溶液 碘液 为 （）；为 碘液；为 ；为 ；为 ；为 图 不同体系的荧光光谱 缓冲溶液（）碘液 图 缓冲溶液用量对体系荧光强度的影响 最佳浓度的选择 的荧光强度与自身浓度有着非常密切的关系。在 容量瓶中加入 缓冲液（），加水定容测定其荧光强度。实验结果如图 所示，水溶液的体积在 范围内时，其荧光强度与体积存在线性关系，当 浓度大于 ，即 体积大于 ，荧光强度趋于稳定，可知 的水溶液超过一定浓度则会形成二聚体甚至多聚体，自熄灭增强，线性关系会消失 。为了实验的线性范围足够大且具有较低的检测限，实验确定 的浓度为 ，即加入 的 溶液。碘液最佳浓度的选择考察 体系在不含有 的情况下，改变碘液用量的情况下对 的荧光猝灭的影响。在 容量瓶内分别加入 ，不同体积的碘液 ，溶液 ，定容至 ，测定其荧光强度。图 分析结果表明，当加入的碘液在 时猝灭的线性度较好，当浓度大于 时体系的荧光强度开始呈现较为平缓的趋势，当加至 时体系荧光强度不再发生明显变化。为了实验具有良好的线性，故碘液用量为 ，此时体系内碘液的浓度为 。最佳反应温度与时间的选择取 标准溶液 、其他条件不变。通过考察在 的温度下体系的荧光强度，可知体系的荧光强度在反应温度为 为最大且变化较小。因 邵阳学院学报（自然科学版）第 卷此，选择室温 为 氧化以及 荧光猝灭反应的最佳温度。（）图 浓度与荧光强度的考察 （）碘液 图 碘液浓度对 荧光强度影响的考察 探究 与碘的氧化以及碘与 缔合 个反应时间对荧光强度的影响。实验结果见图 ，曲线 为 ，标准溶液 ，碘液 ，分别反应 （间隔为 一组）后加入 溶液于 容量瓶定容，静置 后。在不同氧化时间点分别测定的体系荧光强度；曲线 为取 ，标准溶液 ，碘液 ，反应 后加入 溶液定容至 ，分别摇匀静置 （间隔为 一组）后测定不同静置时间下体系的荧光强度。结果表明，与 反应较快，加入瞬间黄色有变化，时反应完全，荧光强度达到最大；与碘缔合在 时反应完全，时荧光强度基本保持不变，因此，加入后的静置时间为 。试剂加入最佳顺序的选择取 的 标准溶液，重点考察了“氧化后缔合”以及“缔合后氧化”两种顺序对荧光强度（）的影响。结果表明顺序为：碘液 ，即先氧化后缔合时体系荧光强度最为稳定，并且此时体系的荧光强度最高。所以实验选择 的加入顺序为最佳。共存物质的影响针对药物中常见的赋形剂和添加剂，实验考察了葡萄糖、淀粉、硬脂酸镁、糊精、蔗糖、乳糖、甘油以及 、等阳离子在优化条件下对测定的干扰。干扰实验表明，当相对误差小于或等于 时，倍的淀粉、葡萄糖、糊精、硬脂酸镁、蔗糖、乳糖以及 倍的金属离子 、对测定结果均无干扰，和 皆可被 氧化，存在一定的干扰。由于药品中附加成分和辅料很少加 ，因此，不在此讨论其干扰情况。标准曲线的绘制分别取一系列浓度的 标准溶液于 容量瓶中按照前面的实验方法测其荧光强度。实验表明，浓度在 时与荧光强度有较好线性，线性方程为 （），相关系数为 ，通过 次空白溶液的测定，用 求得检测限 为 。第 期孙双姣，何芳，邓子璇：基于罗丹明 的荧光探针“关 开”法测定硫普罗宁的含量 （）碘液 为 与碘反应的氧化；为加入 的猝灭图 不同温度与时间的考察 （）碘液 图 浓度与荧光强度差值的线性关系 样品分析分别取来自 个不同厂家的 肠溶片 片于分析天平中准确称重，除去包衣后在研钵中粉碎混匀，精密称取一定量的 粉末，大约相当于 。加水溶解，于 容量瓶中定容，经滤纸过滤，取滤液 定容至 ，作为待测液使用。按照 的实验方法取待测液 进行含量的测定，并进行标准品加入回收实验，所得回收率结果见表 。表 样品分析与回收率的测定（）（）序号 测定平均值（）标示量（）加标量（）测定值（）回收率 结论本实验基于 的荧光“关 开”建立了测定 含量的荧光光谱分析新方法，在 浓度范围内的 与荧光强度有较好的线性，线性回归方程为 （），相关系数 ，为 。利用该方法测定 肠溶片中 的含量，操作简便可行。参考文献：王剑桥 硫普罗宁联合杂合式血液净化治疗急性有机磷中毒的临床疗效 内蒙古医学杂志，（）：，梁建英，杜元平，张昌艳，等 硫普罗宁联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎的临床研究 现代药物与临床，（）：代景丽 硫普罗宁的临床应用及药理作用探讨 数理医药学杂志，（）：邵阳学院学报（自然科学版）第 卷 范文俊，吴霞 阿托伐他汀联合硫普罗宁治疗非酒精性脂肪性肝病患者疗效研究 临床合理用药杂志，（）：安礒，李堪，许晓明，等 测定注射用硫普罗宁的有关物质 中国药科大学学报，（）：刘素琴 基于荧光共振能量转移和超高效液相色谱 串联质谱在硫普罗宁和雌激素分析检测中的应用研究 上海：上海交通大学，刘飞宇，陈晓辉，毕开顺 柱前衍生 高效液相色谱荧光法测定硫普罗宁片含量 药物分析杂志，（）：，（）：何优选，张鹏，梁奇峰 铁（）硫氰酸钾体系褪色光度法测定硫普罗宁含量 化工技术与开发，（）：，林瑜，李见能，韦小玲，等 紫外 可见分光光度法间接测定硫普罗宁的含量 理化检验 化学分册，（）：，（）：李全民，赵伟，刘国光 异丙醇 硫酸铵 水体系浮选硫氰酸亚铜法间接测定硫普罗宁 分析化学，（）：，乔玉春，龙大成，孙宗招，等 罗丹明 荧光猝灭法测定水中碘 化学传感器，（）：，（）：康彩艳，蒋治良，奚旦立 罗丹明 荧光猝灭法测定水中痕量亚氯酸根 光谱学与光谱分析，（）：薛林科，张小林 碘 罗丹明 反荧光猝灭法测定药物中的乙酰半胱氨酸 华西药学杂志，（）：白莹，张小林 碘标准溶液配制方法改进 化学教育（中英文），（）：黄保军，李建军，屈凌波 罗丹明 荧光光谱机理的研究 天津师范大学学报（自然科学版），（）：梁笑语 碘与淀粉显色影响因素的实验探究 当代化工研究，（）：