基于公共基因表达数据库和临床样本队列构建白内障预测模型.pdf

DOI:10.16605/ki.1007-7847.2022.10.0220基于公共基因表达数据库和临床样本队列构建白内障预测模型郭志强1*,张立友2,许利娟1,宫美娜1,韩笑1(1.沧州市第四医院(南皮县人民医院),中国河北 沧州 061500;2.沧州市眼科医院,中国河北 沧州 061000)摘要:基于基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)筛选差异基因,建立白内障预测模型并对其进行评价。首先,采用生物信息学方法从 GEO 中筛选出与白内障相关的芯片数据,并采用 GEO2R 软件和 Net-workAnalyst 工具分析得到最显著的差异表达基因。然后,依托我院健康管理中心白内障筛查队列,采用 Cox比例风险回归构建白内障发病风险预测模型,绘制列线图,通过 C 指数、校准曲线、受试者操作特征(receiveroperating characteristic,ROC)曲线、决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)评价模型的区分度、校准度、预测能力和获益情况。结果显示,在 GSE5645、GSE193629 和 GSE161701 数据集中,鱼精蛋白 1(protamine 1,PRM1)为高表达基因,五羟色胺 2C 受体(serotonin 2C receptor,HTR2C)为低表达基因;白内障组和非白内障组在年龄、体重、收缩压、对比敏感度(contrast sensitivity,CS)、客观散射指数(objective scatter index,OSI)、调制传递函数截止频率(modulation transfer function cut off,MTF cut off)、斯特列尔比(Strehl ratio,SR)、动态视力、PRM1、HTR2C和 CX46 等指标的差异均有统计学意义(P0.05);预测模型最终纳入年龄、OSI、MTF cut off、PRM1 和 HTR2C共 5 个变量(P0。本研究建立的白内障临床预测模型具有很好的区分度、校准度、预测能力、内部有效性和临床效益,具备较高的临床应用价值。关键词:白内障;临床预测模型;列线图;校准曲线;受试者操作特征(ROC)曲线;决策曲线分析(DCA)中图分类号:Q81,R776.1文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)05-0447-08Model Construction for Cataract Prediction Based on PublicExpression Database and Clinical CohortGUO Zhiqiang1*,ZHANG Liyou2,XU Lijuan1,GONG Meina1,HAN Xiao1(1.The Fourth Hospital of Cangzhou City(Nanpi County People s Hospital),Cangzhou 061500,Hebei,China;2.Cangzhou EyeHospital,Cangzhou 061000,Hebei,China)收稿日期:2022-10-27;修回日期:2023-02-13;网络首发日期:2023-04-17基金项目:河北省 2020 年度医学科学研究课题计划(20200343)作者简介:*通信作者:郭志强(1973),男,河北南皮人,副主任医师,主要从事白内障、青光眼、眼底病研究,E-mail:。Abstract:A cataract prediction model was established and evaluated by screening differential genes basedon the Gene Expression Omnibus(GEO)database.Firstly,the microarray data related to cataract were scree-ned from GEO by bioinformatics method and analyzed by GEO2R and NetworkAnalyst software to obtain themost significant differentially expressed genes.Then,based on the cataract screening cohort of the HealthManagement Center of our hospital,a cataract risk prediction model was constructed and the nomogram wasdrawn by using Cox proportional hazards regression.The degrees of differentiation and calibration,predictiveability and benefit of the model were evaluated through C-index,calibration curve,the receiver operatingcharacteristic(ROC)curve and decision curve analysis(DCA).In GSE5645,GSE193629 and GSE161701 da-tasets,protamine 1(PRM1)is a high expression gene,and serotonin 2C receptor(HTR2C)a low expression第 27 卷 第 5 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援5圆园23 年 10 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Oct.圆园23窑 生物信息学 窑生命科学研究圆园23 年白内障是由多种原因导致晶状体代谢紊乱和变性,发生混浊,从而产生视觉障碍的一种疾病1。白内障是首要的致盲因素,其所致盲人数占所有盲人总数的 50%2。白内障根据发生部位可以分为囊膜下、核性和皮质性,病理表现为囊膜弹性变差、悬韧带强度降低、易出现退行性改变,虽然其初期对远视力影响较小,但主观感觉有明显异常,包括暗视力、眩光、重影、强光下模糊等3。临床常用视力表检查和视觉质量评估法筛查白内障,但是效果有限,难以查出早期白内障患者4。近年来,在其他疾病中,不少临床预测模型均纳入了疾病相关基因进行建模,效果显著5。但目前尚没有包含白内障相关基因的预测模型。本研究基于基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)筛选白内障的差异表达基因,构建 Cox 比例风险预测模型并进行评价,为临床上筛查白内障提供参考。1资料与方法1.1差异表达基因筛选采用生物信息学方法,从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Infor原mation,NCBI)的 GEO 数据库中筛选出与白内障相关的芯片数据 GSE5645、GSE193629 和 GSE-161701。其中,数据集 GSE5645 为表达谱芯片,平台号:GPL81 MG_U74Av2 Affymetrix Murine Ge-nome U74A Version 2 Array;数据集 GSE193629为表达谱芯片,平台号:GPL21185 Agilent-072363SurePrint G3 Human GE v3 8x60K Microarray039494;数据集 GSE161701 为测序数据,平台号:GPL24676 Illumina NovaSeq 6000。以上数据集的获取时间为 2022 年 08 月 09 日。采用 GEO2R软件和NetworkAnalyst工具进行分析,通过设置|log2(FC)|(FC:fold change)和 P值得到最显著的差异表达基因,其中|log2(FC)|越大,基因表达水平越高;P值越小,基因在两组间的差异越显著。1.2一般资料白内障筛查队列来源于沧州市第四医院(南皮县人民医院)健康管理中心。按照纳入标准和排除标准,共纳入 2 692 例,其中,男性 1 468 例,女性 1 224 例。根据诊断标准,将所有入组人员分为结局发生白内障者(白内障组,n=564 例)和结局未发生白内障者(非白内障组,n=2 128 例)。纳入标准:年龄逸18 岁;自愿接受且认真配合检查;屈光状态为球镜度数-3.003.00 D,柱镜度数-1.501.50 D;国际标准视力表单眼最佳远视力逸0.8;既往无眼外伤及眼部手术史;签署知情同意书;无重要信息缺失。排除标准:筛查前已确诊白内障者;合并高度屈光不正、角膜病、视神经病变、眼底病变等其他眼病;裂隙灯活体显微镜检查和直接检眼镜检查发现除晶状体混浊外其他异常;因白内障以外其他病因所致视力下降;不服从筛查及试验规定者。本研究已通过沧州市第四医院(南皮县人民医院)伦理委员会批准。1.3诊断标准参照 中华眼科学6白内障的相关诊断:经裂隙灯活体显微镜在暗室内检查,自然瞳孔下晶gene.There were statistically significant differences(P0.05)between the cataract and non-cataract groups inthe age,body mass,systolic blood pressure,contrast sensitivity(CS),objective scatter index(OSI),modulationtransfer function(MTF)cut off,Strehl ratio(SR),dynamic vision,PRM1,HTR2C and CX46.Five variablesincluding age,OSI,MTF cut off,PRM1 and HTR2C were finally included in the prediction model(P0.05).The final prediction model was logh(t)/h0(t)=2.689 2+0.012伊age+1.320伊OSI-0.041伊MTF cut off+0.029伊PRM1-6.549伊HTR2C.The C-index of the model was 0.875,confidence interval(CI)was 0.8620.886,andthe predicted probability was close to the actual probability.The area under the curve(AUC)was 0.904(95%CI:0.8840.923),and the sensitivity and specificity were 82.4%and 92.3%,respectively.The average AUCby the ten-fold crossover method was 0.911.The DCA diagram showed that,when the high risk threshold ofthe model was 0.250.75,the net return rate would be greater than 0.The cataract clinical prediction modelestablished in this study proved to have good differentiation,calibration,prediction ability,internal effective-ness and clinical benefit,and would possess high clinical application value.Key words:cataract;clinical prediction model;nomogram;calibration curve;receiver operating characteris-tic(ROC)curve;decision curve analysis(DCA)（Life Science Research，2023，27（5）：447-454）448第 5 期郭志强等：基于公共基因表达数据库和临床样本队列构建白内障预测模型状体皮质混浊(以皮质混浊为主,核无或仅见轻微混浊,无后囊及囊下混浊),晶状体内可见空泡、水裂或板层分离。1.4调查方法白内障筛查队列的数据包括一般检查指标身高、体重、身体质量指数(body mass index,BMI)、舒张压、收缩压、实验室检查指标谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、血肌酐(creatinine,Cr)、空腹血糖和问卷调查三部分内容。一般检查指标与实验室检查指标由医生和筛查员获得。一般情况(年龄)、生活习惯(吸烟、饮酒)和其他疾病(高血压、糖尿病、高脂血症)等信息通过问卷调查获得。随访以了解研究对象的患病情况。1.5视觉质量评估采用以下指标进行视觉质量评估7。1)对比敏感度(contrast sensitivity,CS):采用德国 OCU-LUS Binoptometer4 双目视力仪检测,使用对比度形式,通过不同对比度设置(80.0%、40.0%、20.0%、10.0%、5.0%、2.5%),让受试者识别视标,从而获取对比敏感度;2)客观散射指数(objective scatter in-dex,OSI):使用 OQASTM域(欧卡斯)客观视觉质量分析系统(西班牙 Visiometrics 公司),经综合验光仪验光矫正后戴镜进行检查;3)调制传递函数截止频率(modulation transfer function cut off,MTFcut off):测量方法同 OSI;4)斯特列尔比(Strehl ra-tio,SR):测量方法同 OSI;5)动态视力:使用 TD-J905 动态视力检测仪(上海驼峰自动化技术有限公司)进行测量,在规定时间内辨别不同速度运动视标,测量受试者的动态视力。1.6基因表达水平的实时荧光定量 PCR 检测采集受试者清晨空腹静脉血 5 mL 于 EDTA抗凝管中,采用天根生化科技有限公司试剂盒(货号:DP419)提取总 RNA,使用紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司,型号:NanoDrop 2000)检测RNA 浓度,将 RNA 反转录成 cDNA。采用实时荧光定量 PCR 仪(Bioneer 公司,型号:Exicycler 96)扩增 cDNA,具体程序如下:94 益热启动 5 min;94 益变性 10 s,70 益延伸 50 s,共 40 个循环;40 益退火 50 s。采用 GAPDH 作为内参,通过 2-吟吟Ct法计算 CX46 基因、鱼精蛋白 1(protamine 1,PRM1)和五羟色胺 2C 受体(serotonin 2C receptor,HTR2C)的 mRNA 表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司提供,序列如下:PRM1 上游引物为 5忆-AGAGCTGTGAGGACGATCACG-3忆,下游引物为5忆-TGCACTGGTCTATCTCACTTCG-3忆;HTR2C 上游引物为 5忆-AGTCATGTAGCTAGCTAGCTAA-3忆,下游引物为 5忆-ACTAACGTAGCCAGCTAGCTGA-3忆;CX46 上游引物为 5忆-GACTCATCACCATCA-ATGA-3忆,下游引物为 5忆-ACATTCTTTAGGCA-CGCCT-3忆;GAPDH 上游引物为 5忆-ATCCCATC-ACCATCTTCC-3忆,下游引物为 5忆-TGACCCTT-TTGGCTCCCC-3忆。1.7数据处理GEO 数据库表达谱芯片采用 GEO2R 软件进行分析,临床数据采用 SPSS 软件和 R 4.0.4 软件进行分析。计量资料用(x依s)表示,采用 Kolmogorov-Smirnov 检验数据是否符合正态分布。若数据符合正态分布则进一步检验方差齐性,如果方差齐,采用 t 检验;如果方差不齐,采用校正 t 检验。若数据不符合正态分布,则采用非参数秩和检验。计数资料用例(%)表示,采用 字2检验或 Fisher 精确概率检验。使用 Cox 回归分析筛选协变量并构建 Cox 比例风险回归预测模型。使用 R 软件的rms 包绘制列线图,计算 C-指数,评价模型的区分度,同时绘制校准曲线,评价模型的校准度。采用受试者操作特征(receiver operating characteris原tic,ROC)曲线下面积(area under the curve,AUC)评价模型的预测能力,并使用十折交叉验证法对模型进行内部验证。使用 R 软件的 mda 包绘制决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)图,评价模型的获益情况。P2 且 P3 且 P0.01 的基因有 2 个,其中,高表达基因 1 个,为 PRM1,低表达基因 1 个,为HTR2C。在 GSE193629 数据集中,PRM1 的|log2(FC)|=3.34,P=0.002;HTR2C 的|log2(FC)|=4.16,P=0.007。在GSE161701 数据集中,PRM1 的|log2(FC)|=4.25,P=0.003;HTR2C 的|log2(FC)|=3.61,P=0.005。以上结果表明,PRM1 和 HTR2C 在 3 个基因集中均存在差异表达。2.2队列基线特征描述本研究使用的白内障筛查队列的平均随访时间为(1.06依0.37)年,随访时间中位数为 1.12 年。随449生命科学研究圆园23 年图 1GSE5645 数据集中差异表达最显著的两个基因Fig.1The two most differentially expressed genes in theGSE5645 dataset表 1队列基线特征描述Table 1Description of the baseline characteristics of the cohortGeneral informationAge(x依s,year)Male n(%)Height(x依s,cm)Weight(x依s,kg)BMI(x依s)Smoke n(%)Alcohol n(%)Hypertension n(%)Systolic blood pressure(x依s,mmHg)Diastolic blood pressure(x依s,mmHg)Hyperlipidemia n(%)Diabetes n(%)Fasting blood glucose(x依s,mmol/L)ALT(x依s,U/L)Cr(x依s,滋mol/L)CS(x依s)OSI(x依s)MTF cut off(x依s,c/d)SR(x依s)Dynamic vision(x依s)Cataract group(n=564)65.67依7.72298(52.84)162.83依7.9569.84依11.0225.91依3.1284(14.89)129(22.87)226(40.07)139.68依21.5281.56依12.89217(38.48)63(11.17)5.96依1.6725.92依3.5857.81依8.521.32依0.121.78依0.1624.62依3.180.13依0.030.24依0.04Non-cataract group(n=2 128)58.31依7.681 129(53.05)162.92依8.0166.83依10.9325.82依3.10320(15.04)489(22.98)867(40.74)134.23依19.8281.53依12.72822(38.63)236(11.09)5.89依1.6926.37依3.6458.93依8.451.63依0.150.65依0.1237.89依3.360.18依0.040.53依0.06t/字215.2370.3370.7525.3171.9480.2570.3160.2847.3210.9720.0492.3411.627-1.8671.613-5.1679.348-10.562-7.264-13.561P value0.010.5160.4830.010.1830.6120.5270.5940.010.3160.9760.1270.1350.1540.1390.010.010.010.010.01表 2白内障组与非白内障组 PRM1、HTR2C 和 CX46 的表达水平比较Table 2Comparison of PRM1,HTR2C and CX46 expression levels between cataract and non-cataract groups(x依s)GroupNon-cataract groupCataract grouptPn2 128564PRM11.00依0.171.69依0.2122.9340.001HTR2C1.00依0.140.76依0.11-12.0570.001CX461.00依0.160.85依0.12-20.7730.00143210-404log2(fold change)UpNo significantDownHTR2CPRM1访期间共确诊新发白内障 564 例。从表 1 可知,白内障组和非白内障组在年龄、体重、收缩压、CS、OSI、MTF cut off、SR 和动态视力等指标的差异均有统计学意义(P0.05)。2.3基因表达水平比较在结果 2.1 中,虽然差异表达最明显的 2 个基因不包括 CX46,但其表达量在两组间仍有明显的分离趋势,且该基因与结果 2.1 中的基因PRM1 和 HTR2C 存在功能上的相关性,故一并纳入分析。从表 2 和图 2 可知,白内障组 PRM1 的表达水平明显高于非白内障组(t=22.934;P0.001),HTR2C 和 CX46 的表达水平明显低于非白内障组(t 分别为-12.057 和-20.773;P0.001)。2.4多因素 Cox 回归分析建立预测模型将上述有统计学意义的指标纳入 Cox 比例风险回归模型,进行多因素分析和变量筛选,以构建白内障风险预测模型。最终纳入年龄、OSI、MTFcut off、PRM1 和 HTR2C 共 5 个变量(P1,MTF cut off 和 HTR2C是白内障的保护因素(HR1)。常数项为 2.689 2。450第 5 期表 3多因素 Cox 回归分析结果Table 3Results of multivariate Cox regression analysis图 2白内障组与非白内障组 PRM1、HTR2C 和 CX46 的表达水平比较Fig.2Comparison of PRM1,HTR2C and CX46 expres-sion levels between cataract and non-cataract groups*:P约0.001.VariableAgeOSIMTF cut offPRM1HTR2C茁0.0121.320-0.0410.029-6.549HR1.0123.7420.9601.0300.097Confidence interval1.0011.0222.4655.6800.9360.9841.0031.0590.0160.149P value0.0330.010.0120.0390,模型有临床意义;且高风险阈值取值越小,净收益率越大,说明该模型具有很好的临床效益。3讨论白内障的发病机制比较复杂。有研究表明,年龄、性别、种族、代谢、遗传等多种因素均在白内障的发展中扮演重要角色8;紫外线、糖尿病、高血压、心血管疾病、饮酒、吸烟等因素也可诱发白内障的形成9。白内障患者的晶体混浊主要分布于周边,视轴区晶体尚处于透明状态,远视力暂未发生变化,视力表检查难以发现问题10。目前,临床上主要采用超声乳化白内障摘除联合人工晶状体植入术治疗白内障,但是术后易出现眼内炎、黄斑水肿、后囊膜破裂、眼干燥症等并发症11-12。所以,早期筛查与诊断仍是目前应对白内障的最佳策略。预测模型的指标选择至关重要。本研究结果表明,从 GEO 数据库中筛选的 PRM1 和 HTR2C这 2 个基因满足|log2(FC)|3 且 P1),MTFcut off 和 HTR2C 是白内障的保护因素(HR1)。目前,关于白内障的预测模型多数是病例对照研究,主要是回顾性分析已收集的临床资料,预测模型多采用 logistic 回归模型。比如:黄伟梅等25通过建立模型对采用复明 2 号车行白内障手术后的感染风险进行了预测研究。该研究假定两组患病率是相同的,这往往与真实情况有差异。而本研究采用的是前瞻性队列研究设计,预测模型采用的是 Cox 比例风险回归模型,证据等级高于回顾性分析,而且通过列线图这种可视化的方式,能直观计算出每一个研究对象的白内障发病风险。在模型评价方面,大多数研究只采用 ROC曲线和 AUC 评价模型的预测能力。比如:杨惠春等26在构建预测模型后,用 ROC 曲线评价晶状体溶解性青光眼患者白内障术后高眼压风险。目前尚未见使用校准曲线和 DCA 曲线评价白内障预测模型的研究。而本研究采用校准曲线、C-指数、ROC 曲线和 DCA 曲线 4 种评价方法,分别验证了模型的校准度、区分度、预测能力和获益情况。结果表明,该模型具有很好的区分度、校准度、预测能力和临床价值,为模型的临床应用提供了全面的证据。本研究表明,性别、吸烟、饮酒和糖尿病这 4个因素在组间没有明显差异(表 1),原因可能有以下三点。1)报告偏倚:在问卷调查中,研究对象可能隐瞒吸烟、饮酒和糖尿病史;2)样本量偏小:有的白内障研究纳入了超 8 000 例研究对象,结果提示存在组间差异27;3)选择偏倚:由于本研究是针对健康人及可能具有白内障患病危险因素的人群进行的筛查,排除了已确诊的白内障患者和视力严重损害者,所以可能导致上述 4 个因素在健康人和白内障初期患者中没有明显差异。另外,身高、体重、收缩压、ALT、Cr、CS、SR 这些因素在单因素分析中有明显差异(P0.05),原因可能有以下两点。1)区分度较低:某些因素虽然在两组间差异明显,但建模时未能达到很好的区分度,不能很好预测结局,导致模型预测效率下降,故被模型舍弃;2)多重共线性:某些因素可以被其他因素通过线性关系解释,导致其成为多余变量,故被模型舍弃。综上所述,本研究建立的白内障临床预测模型具有很好的区分度、校准度、预测能力、内部有效性和临床效益,能够为识别白内障高危人群、评估患病风险提供有力证据,具备较高的临床应用价值。参考文献(References):1XU J J,FU Q L,CHEN X J,et al.Advances in pharmacotherapyof cataractsJ.Annals of Translational Medicine,2020,8(22):1552.2GARAY-ARAMBURU G,BERGADO-MIJANGOS R,IRIZAR-AMILLETA R,et al.Risk factors for predicted refractive errorafter cataract surgery in clinical practice.Retrospective obser-vational studyJ.Archivos de la Sociedad Espa觛 nola de Oftal-molog侏a(English 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