基于高通量测序分析不同发酵方式下黄精泡菜中微生物多样性.pdf
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1、食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2023.21.020基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(32300334);河南省高等学校青年骨干教师培养计划(2019GGJS045);2023 年教育部中西部高等学校青年骨干教师国内访学项目;河南省高等学校重点科研项目(20B360002);河南农业大学自然科学类创新基金项目(KJCX2019A02);河南省大学生创新创业训练项目(202210466054)作者简介:焦佳音(1999),女(汉),硕士研究生,研究方向:药食同源植物资源开发与利用。*通信作者:洪利亚(
2、1984),女(回),讲师,博士,研究方向:药食同源植物资源开发与利用。基于高通量测序分析不同发酵方式下黄精泡菜中微生物多样性焦佳音1,李嘉瑜1,樊淑淼1,王磊1,郑芸霏1,李明婉2,李瑜3,李连珍1,洪利亚1,4*(1.河南农业大学 农学院,河南 郑州 450046;2.河南农业大学 林学院,河南 郑州 450046;3.河南农业大学 食品科学技术学院,河南 郑州 450046;4.北京大学 药学院,北京 100191)摘要:为探明母水发酵和接种发酵对黄精泡菜品质的影响,该文研究黄精泡菜发酵过程的相关理化指标和感官评价,并利用高通量测序方法分析不同发酵时间黄精泡菜中微生物群落组成和多样性的变
3、化。结果表明,两种黄精泡菜发酵第 3 天时 pH 值为 3.0,母水发酵总酸含量为 11.9 g/kg,接种发酵总酸含量为 7.3 g/kg,母水发酵第 3 天和接种发酵第 5 天成熟度最好,质地脆嫩、汁液清亮。两种黄精泡菜亚硝酸盐含量远低于标准限量(20 mg/kg)。通过微生物群落结构分析发现,两种黄精泡菜优势菌门是厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria);属水平上,接种发酵优势属是植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus),而母水发酵优势属是植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus)、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacill
4、us)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和嗜戊糖乳杆菌属(Secuutliactobacillus)。Alpha 多样性指数分析表明两种黄精泡菜微生物群落丰富度相近,母水发酵微生物多样性高于接种发酵;主成分分析表明,两种黄精泡菜微生物群落结构差异较大,母水发酵群落结构随发酵时间变化较大。关键词:黄精泡菜;高通量测序;发酵方式;微生物;理化性质High-Throughput Sequencing Reveals Microbial Diversity in Polygonatum sibiricumPickles Fermented with Different MethodsJIAO
5、Jiayin1,LI Jiayu1,FAN Shumiao1,WANG Lei1,ZHENG Yunfei1,LI Mingwan2,LI Yu3,LI Lianzhen1,HONG Liya1,4*(1.College of Agronomy,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,Henan,China;2.College ofForestry,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,Henan,China;3.College of Food Science andTechnolog
6、y,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,Henan,China;4.School of PharmaceuticalSciences,Peking University,Beijing 100191,China)粤遭泽贼则葬糟贼:The effects of brine fermentation and inoculated fermentation on the quality of Polygonatum sibiricumpickles were examined based on physicochemical indicato
7、rs and sensory quality.In addition,high-throughputsequencing was employed to analyze the microbial community composition and diversity in P.sibiricum pickles atthe differentfermentationstages.The resultsrevealedthat the P.sibiricum pickles fermented with the two methodsremained pH3.0 on day 3.The pi
8、ckles fermented with the brine method and inoculation method had the total acidcontent of 11.9 g/kg and 7.3 g/kg,respectively.The brine fermented pickles had the optimal maturity with crisptexture and clear juice on day 3,while the pickles fermented with the inoculation method reached the optimalmat
9、urityonday5.ThenitritelevelsofP.sibiricumpicklesfermentedwiththetwomethodswerelessthan1.7mg/kg,below the national safety standard limit of 20 mg/kg.Firmicutes and Proteobacteria were the dominant phyla in thetwo groups.Lactiplantibacillus was the dominant genus in the inoculated fermentation group,w
10、hile Lactipla-ntibacillus,Lentilactobacillus,Lactobacillus,and Secuutliactobacillus were the dominant genera in the brinefermentation group.The microbial richness in P.sibiricum pickles was comparable between the two groups,whilethe brine fermentation group exhibited higher microbial diversity than
11、the inoculated fermentation group.The生物工程145食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期principal component analysis demonstrated a significant disparity in the microbial community structure betweenthe two groups,and the microbial composition of the brine fermented pickles changed greatly over the fermenta原tionti
12、me.运藻赠 憎燥则凿泽:Polygonatum sibiricum pickles;high-throughput sequencing;fermentation method;microorgan原ism;physicochemical property引文格式:焦佳音,李嘉瑜,樊淑淼,等.基于高通量测序分析不同发酵方式下黄精泡菜中微生物多样性J.食品研究与开发,2023,44(21):145-151.JIAOJiayin,LI Jiayu,FANShumiao,etal.High-Throughput SequencingRevealsMicrobialDiversity in Poly
13、gonatumsibiricumPicklesFermentedwithDifferentMethodsJ.Food Research and Development,2023,44(21):145-151.黄精(Polygonatum sibiricum)为百合科黄精属多年生草本植物,口味甘甜,营养丰富,含有多糖、黄酮类、氨基酸和矿物质等成分1-3,具有抗氧化、抗衰老、降血糖及改善记忆力等功效4-6。黄精作为药食同源的食材,市场上已开发出黄精茶7、黄精果酒8、黄精酸奶9、黄精饼干10等多种产品,市场占有率较高且深受消费者喜爱,黄精深加工及综合利用已成为研究热点。泡菜是我国传统发酵制品,富含多
14、种纤维素、氨基酸和微量元素,能促进肠道蠕动、提高人体免疫力11。泡菜发酵是一个多菌种发酵过程,不同发酵方式菌群结构存在差别12。母水发酵是四川泡菜的特色工艺,在泡菜中加入母水可增强泡菜中微生物群落的稳定性并保持其原有风味13。接种发酵同样常用于泡菜制作,采用人工接种特定发酵剂进行发酵,具有缩短泡菜发酵周期、减少杂菌污染和降低亚硝酸盐含量等优势14。目前已有将中药材或者药食同源材料制作泡菜的研究,如山药15、黄芪16、桔梗17等,但关于黄精泡菜还鲜有报道,本研究采用母水发酵和接种发酵腌制黄精泡菜,通过感官评分、pH 值、总酸含量及亚硝酸盐含量测定,并利用高通量测序技术分析两种发酵方式中微生物多样
15、性的差异,以期为黄精泡菜产业化生产提供理论依据和技术参考。1材料与方法1.1材料与试剂黄精:登封市土鑫种植专业合作社,经河南农业大学洪利亚博士鉴定为百合科黄精属植物黄精;白酒:泸州老窖股份有限公司;盐:中盐河南盐业物流配送有限公司;泡菜发酵菌:广东顺德尚川生物科技有限公司;四川泡菜母水:江油蜀味山珍贸易有限公司;姜、花椒、小米辣、大蒜、冰糖:市售。氢氧化钠:上海麦克林生化有限公司;硫酸锌、正辛醇、硝酸钾、酚酞指示剂:国药集团化学试剂有限公司;95%乙醇:上海泰坦科技有限公司;亚铁氰化钾、N-1-萘乙二胺盐酸盐、无水对氨基苯磺酸:天津市光复精细化工研究所;乙酸锌:汕头市西陇化工厂;TGuide
16、S96 磁珠法土壤/粪便基因组 DNA 提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司;DNA 聚合酶:北京全式金生物技术有限公司;DNA 精确扩增试剂盒:美国 Axygen 公司;DNA 文库制备试剂盒:美国 Illumina公司。以上化学试剂均为分析纯。1.2仪器与设备250A 生化培养箱:宁波普朗特仪器有限公司;HH数显恒温水浴锅:郑州生元仪器有限公司;KQ-400DE型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;MR1029 破壁料理机:广东新宝电器股份有限公司;721紫外可见分光光度计:上海康华生化仪器制造有限公司;PHS-3E 精密 pH 计:上海仪电科学仪器股份有限公司;Synergy
17、HTX 酶标仪:基因有限公司;OSE-MC8瞬时离心机:天根生化科技(北京)有限公司;Veriti96梯度基因扩增仪:美国应用生物系统公司;H1650-w医用离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;BE-1100 四维旋转混匀仪:海门市其林贝尔仪器制造有限公司。1.3试验方法1.3.1工艺流程原料准备、初加工寅沥干水分寅器具灭菌寅调盐浓度寅接种寅装坛寅白酒密封寅25 益恒温发酵寅成品。1.3.2操作要点选取无发霉腐烂、水分充足、根茎幼嫩的一年生黄精为原料,去除表皮和杂质,洗净后切至 1 cm伊1 cm伊1 cm 小块,置于 7%盐水中充分浸泡去除麻舌感,清洗去除盐味后沥水备用。按黄精 颐 凉开
18、水=1 颐 2 的质量比装入泡菜坛,再添加 3.0%盐和 4.0%冰糖搅拌均匀,按黄精质量 0.1%添加菌粉或 7.0%添加母水发酵液,并依次加入适量姜、大蒜、小米辣、花椒和白酒,密封后生物工程146食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期25 益恒温发酵 7 d。发酵至第 1、3、5、7 天时进行采样以测定相关指标,母水发酵样品标记为 M1、M3、M5、M7,接种发酵样品标记为 J1、J3、J5、J7。1.3.3评价与测定1.3.3.1感官评价由食品专业人员 20 名(男 10 名,女 10 名)组成感官评价小组对黄精泡菜进行感官评价,分别从色泽、香味、风味、质地进行评分
19、,满分 100 分,感官评分标准见表 1。1.3.3.2理化指标测定总酸含量参照 GB 124562021 食品安全国家标准 食品中总酸的测定 中酸碱指示剂滴定法进行测定;pH 值参照 GB 5009.2372016 食品安全国家标准食品 pH 值的测定 中 pH 计法进行测定;亚硝酸盐含量参照 GB 5009.332016 食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 中盐酸萘乙二胺法进行测定,以亚硝酸钠为标准品绘制标准曲线所得线性回归方程为 y=0.030 3x+0.002 1(R2=0.999 2),根据标准曲线计算样品中亚硝酸盐含量。1.3.3.3总 DNA 提取和聚合酶链式反应扩增
20、总 DNA 提取按照 TGuide S96 磁珠法土壤/粪便DNA 提取试剂盒的说明书方法进行测定,使用 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA,引物引用:338F(5-ACTCC原TACGGGAGGCAGCA-3)和 806R(5-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT-3)。扩增体系(10 滋L):基因组 DNA550 ng,Vn F(10 滋mol/L)0.3 滋L,Vn R(10 滋mol/L)0.3 滋L,KOD FX Neo Buffer 5 滋L,dNTP(2 mmol/L)2 滋L,KOD FX Neo 0.2 滋L,ddH2O 补充至 10 滋L;扩增参数:95 益 5 mi
21、n,95 益 30 s,50 益 30 s,72 益 40 s,72 益 7 min,4 益保持 2530 次循环。1.3.3.4测序数据处理与分析微生物多样性是基于 Illumina Novaseq 测序平台,利用双末端测序的方法,构建小片段文库进行测序。原始数据采用 Trimmomatic v0.33 软件进行过滤,Cutadapt1.9.1 软件进行引物序列的识别与去除,得到不包含引物序列的 Clean Reads。Usearch v10 软件通过 overlap对每个样品的 Clean Reads 进行拼接,然后根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤。随后使用UCHIME v4
22、.2 软件鉴定并去除嵌合体序列,得到最终有效数据。使用 Usearch 软件对 Reads 在 97.0%的相似度水平下进行聚类、获得分类操作单元(operationaltaxonomic units,OTUs);利用 QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表,再利用 R 语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图;使用 QIIME2 软件,对样品 Alpha 多样性指数进行评估;使用 QIIME 软件进行 Beta 多样性分析。2结果与分析2.1发酵方式对黄精泡菜 pH 值的影响pH 值作为指标参数有效表现出发酵环境和泡菜的成熟状态18。发酵方式对黄精泡菜 pH 值的影响见图 1。由
23、图 1 可知,发酵时间为 13 d 时,两种发酵方式下黄精泡菜 pH 值均呈现快速下降的趋势,第 3 天 pH值达到 3.0,处于稳定状态,表明两种发酵方式黄精泡菜在第 3 天开始成熟。2.2发酵方式对黄精泡菜总酸含量的影响发酵方式对黄精泡菜总酸含量的影响见图 2。由图 2 可知,黄精泡菜发酵过程中接种发酵总酸含量始终低于母水发酵,两种发酵方式黄精泡菜初期总酸含量均较低,可能是发酵初期微生物处于适应期;发酵时间为 13 d 时,两种发酵方式黄精泡菜总酸含量增长较快,接种发酵第 3 天总酸含量为 7.3 g/kg,母水发酵总酸含量为 11.9 g/kg;接种发酵 37 d 时,总酸含量增长速度降
24、低,第 7 天总酸含量为 10.8 g/kg;母水发酵 37 d 时,总酸含量呈先上升后下降的趋势,推测表 1感官评价标准Table 1Sensory evaluation criteria感官项目标准评分色泽(25)色泽均匀,鲜亮,有光泽1525色泽均匀,光泽度较差515色泽发黑,无光泽15香味(25)发酵香气浓郁,有酯香气味1525发酵香气一般,酯香气味稍淡515无发酵香气,有不良气味15风味(25)酸甜咸适中,味道鲜美,具有明显黄精风味1525酸甜咸可接受,味道较鲜美,黄精风味较淡515酸或过咸,难以入口,无黄精味或黄精有刺激性15质地(25)质地脆嫩,形态完整,有咀嚼感1525质地较脆
25、嫩,稍松软,形态较完整515质地松软,形态不完整15图 1发酵方式对黄精泡菜 pH 值的影响Fig.1Effects of fermentation methods on pH value ofP.sibiricum pickles4.03.53.02.52.0137发酵时间/d5接种发酵母水发酵生物工程147食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期由于母水发酵在发酵后期有机酸和 H+进一步积累,乳酸代谢途径因乳酸的积累产生反馈抑制作用19。研究表明总酸含量在 6.08.0 g/kg 时的口感较佳20,母水发酵 13 d 达到最佳酸度范围,而接种发酵 35 d 才到达最佳酸
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