基于明胶_六偏磷酸钠_谷氨酰胺转氨酶复合水凝胶包埋体系的构建及作用机理.pdf
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1、食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 81基于明胶/六偏磷酸钠/谷氨酰胺转氨酶复合 水凝胶包埋体系的构建及作用机理刘治芹1,陈俊亮1,任广跃1,2,*,段 续1,2,曹伟伟1,李琳琳1,赵梦月1,金 鑫1(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471000;2.粮食储藏安全河南省协同创新中心,河南 郑州 450001)摘 要:研究以明胶(gelatin,GE)和六偏磷酸钠(sodium hexametaphosphate,SHMP)为原料,制得初级网络水凝胶,添加植物乳杆菌后采用谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)进一步交联构建复合水凝胶包
2、埋体系,以期提高植物乳杆菌的存活率和生物利用度。结果表明,经SHMP和TGase修饰后改变了GE的凝胶强度、水分分布状态及凝胶网络结构,同时降低了凝胶形成速率,使凝胶的三维网络结构更加稳定,GE/SHMP/TGase复合水凝胶包埋体的分子间作用力较强,有利于包埋的植物乳杆菌的抵抗不良环境的影响。通过扫描电子显微镜发现植物乳杆菌的存在轻微破坏了水凝胶的有序结构。内源荧光光谱分析表明植物乳杆菌的加入导致GE分子内含有的色氨酸的延伸区暴露在更极性的环境中,在水凝胶胶凝过程中出现空间位阻效应,延缓了生物聚合物分子间共价交联和物理相互作用的形成,从而导致其微观结构发生改变。模拟胃肠道消化实验及贮藏实验表
3、明,与单一的GE基水凝胶相比,GE/SHMP/TGase凝胶中植物乳杆菌具有更高的益生菌细胞存活率及胃肠道释放特性。证实了GE/SHMP/TGase复合水凝胶对植物乳杆菌具有较好的保护作用。本研究探索了一种制备益生菌递送系统的新方法,为益生菌功能性食品的开发提供理论依据。关键词:复合水凝胶包埋体系;植物乳杆菌;六偏磷酸钠;明胶;谷氨酰胺转移酶 Construction and Mechanism of Action of Gelatin/Sodium Hexametaphosphate/Glutamine Aminotransferase Based Composite Hydrogel Sy
4、stemLIU Zhiqin1,CHEN Junliang1,REN Guangyue1,2,*,DUAN Xu1,2,CAO Weiwei1,LI Linlin1,ZHAO Mengyue1,JIN Xin1(1.College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China;2.Henan Collaborative Innovation Center for Grain Storage Security,Zhengzhou 450001,China)Abs
5、tract:In this study,a composite hydrogel system was constructed by cross-linking of primary network hydrogels of gelatin(GE)and sodium hexametaphosphate(SHMP)by transglutaminase(TGase)after addition of Lactobacillus plantarum in order to improve its viability and bioavailability.The experimental res
6、ults showed that the modification by SHMP and TGase changed the gel strength,water distribution state,and gel network structure of gelatin,and reduced the gelation rate,so that the three-dimensional network structure of the gel was more stable,and the intermolecular forces of the composite hydrogel
7、was stronger,contributing to the resistance of the encapsulated L.plantarum to adverse environments.The presence of L.plantarum was found to slightly disrupt the ordered structure of the hydrogel by scanning electron microscopy(SEM).Endogenous fluorescence spectroscopy analysis showed that addition
8、of L.plantarum resulted in the exposure of the extended region containing tryptophan within the GE molecule to a more polar environment.The steric effect occurred during the gelling process,delaying the formation of covalent crosslinks and physical interactions between the biopolymer molecules,which
9、 led to changes in their microstructure.Simulated gastrointestinal digestion tests and storage tests showed that L.plantarum encapsulated in GE/SHMP/TGase gels had better survival rates and gastrointestinal release properties 收稿日期:2022-08-16基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31601450);“十三五”国家重点研发计划重点专项(2017YFD04
10、00901);国家自然科学基金面上项目(32172352);河南省科技攻关项目(202102110077);河南省高校重点科研项目(20A550006);河南省高等学校青年骨干教师培养计划项目(2020GGJS072)第一作者简介:刘治芹(1996)(ORCID:0000-0002-9987-2591),女,硕士研究生,研究方向为生物与医药方向。E-mail:*通信作者简介:任广跃(1971)(ORCID:0000-0002-5504-3599),男,教授,博士,研究方向为农产品干燥技术。E-mail: 82 2023,Vol.44,No.16 食品科学 食品化学compared to sin
11、gle GE-based hydrogels.It was confirmed that GE/SHMP/TGase hydrogels had a better protective effect on L.plantarum.In conclusion,this study has explored a new method for preparing GE-based hydrogels as a delivery system for probiotics,which will provide a theoretical basis for the development of pro
12、biotic functional foods.Keywords:composite hydrogel system;Lactobacillus plantarum;sodium hexametaphosphate;gelatin;transglutaminaseDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220816-196中图分类号:TS255.36 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)16-0081-10引文格式:刘治芹,陈俊亮,任广跃,等.基于明胶/六偏磷酸钠/谷氨酰胺转氨酶复合水凝胶包埋体系的构建及作用机理J.食品科学,2023,44(16):81-9
13、0.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220816-196.http:/ LIU Zhiqin,CHEN Junliang,REN Guangyue,et al.Construction and mechanism of action of gelatin/sodium hexametaphosphate/glutamine aminotransferase based composite hydrogel systemJ.Food Science,2023,44(16):81-90.(in Chinese with English abstract)DOI:10.750
14、6/spkx1002-6630-20220816-196.http:/植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)可以平衡肠道微生物菌群,提高免疫功能,但由于植物乳杆菌在食品制造、运输、储存及人体胃肠道消化过程中会遇到环境压力,如高温、盐、氧气及胃液和胆盐等因素的影响,从而降低生物利用度,限制其功能特性的发挥1。为提高益生菌的稳定性和生物利用率,近年来已对益生菌的保护和递送机制进行了大量研究。水凝胶是由一种或多种天然或合成聚合物组成,通过化学共价键结合或非共价键进行物理交联,具有独特的三维交联网状结构,能够吸收大量水和体液而不溶解2。水凝胶能够保护益生菌免受其在食品加工过程中恶
15、劣条件的影响,同时凝胶基质可以抵抗载体在胃肠道发生化学和酶降解,并有效地在结肠中释放其负载的生物成分,是目前研究中发现的一项较好的益生菌保护机制3-4。明胶(gelatin,GE)是由胶原蛋白部分水解而来,是一种常用的蛋白质类水凝胶。由于GE包含了水凝胶及蛋白质的所有特征,具有良好的热可逆凝胶形成性、透明度、遇冷水不溶和体温熔点、促进细胞黏附等特征,且通过使用物理、化学和酶处理可以使本身具有优良性质的GE转变为水凝胶,使其成为益生菌包埋的重要材料5。Vaziri等6以海藻酸/果胶/GE为壁材对植物乳杆菌与富含DHA的油进行共包埋。Lopes等7将GE与海藻酸钠混合采用挤压法包埋鼠李糖乳杆菌。但
16、GE与多糖之间是通过静电相互作用与阴离子多糖形成络合物,形成的凝胶强度较弱、稳定性和机械强度差、弹性低和对热敏感,在外部环境下具有分解或降解的趋势。研究表明GE的疏水氨基酸,如酪氨酸和脯氨酸,也可以用戊二醛、二异氰酸酯、碳二亚胺等进行交联获得稳定的凝胶材料,但是这些物质绝大多数有毒限制了其在食品工业中的应用。而磷酸化是一种改善蛋白质的功能性质有效且安全经济的方法,它可以通过增加蛋白质的电负性和降低蛋白质的等电点改变蛋白质的电荷状态8。蛋白质经磷酸化后,具有优良的功能性质,如胶凝、起泡、溶解、钙吸收、乳化性等,而且食品蛋白质的某些生理功能也可以通过磷酸化改善或赋予9。Cen Shijie等10研
17、究了焦磷酸钠对鱼胶的凝胶、流变性和结构性能的影响。结果表明,磷酸化修饰显著提高了鱼GE的凝胶强度、结构性能、乳化性能和乳化稳定性。就食品安全而言,酶促磷酸化是食品蛋白质改性的最理想的方法,因为酶反应通常在更为温和的条件下产生均匀的产物。谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)能催化蛋白质之间(或蛋白质内部)的酰基转移反应,使蛋白质之间发生非共价交联,这种交联可以明显改善蛋白质的胶凝能力、热稳定性和持水性等11-12。如Chen Tianhong等13使用TGase催化GE/壳聚糖复合凝胶提高了GE的胶凝能力,Huang Tao等14使用TGase改善鱼GE/果胶复合物的凝
18、胶性质。虽然已有研究就GE水凝胶改性及包埋进行了大量研究。然而,已有关GE水凝胶及包埋体的研究主要针对乳清蛋白与多糖类聚合体等形成互穿插网络水凝胶,对于将TGase和六偏磷酸钠(sodium hexametaphosphate,SHMP)联合用于GE的修饰并作为益生菌包埋载体的研究相对较少。而SHMP无毒且易于胶凝,在溶液中会被水解成简单的磷酸盐,这种磷酸盐通常存在于任何生物体的细胞膜中,使其具有良好的生物相容性,已被证实是一种有效改进蛋白质凝胶性能的方法15。如Mccarthy等16 发现添加SHMP可以增强浓缩乳清蛋白的功能特性,降低分散体的黏度。Rasouli等17研究了不同胶体和SHM
19、P对乳清浓缩蛋白分散体的热稳定性、流变性能、微观结构及感官特性的影响,发现添加SHMP可使蛋白质稳定性提高,表观黏度改善。此外,TGase可以使蛋白质之间发生共价交联,这种交联可以使GE的结构更加稳定。因此,研究通过SHMP对GE进行修饰构建初级网络水凝胶,加入植物乳杆菌后利用TGase进一步修饰GE/SHMP,使其更有利于植物乳杆菌递送,以GE、GE/SHMP水凝胶及包埋体作为对照,利用物理和化学分析方法对水凝胶复合体系的结构及性能进行分析,探讨GE/SHMP/TGase的作用机理及包埋植物乳杆菌后对水凝胶性能的影响,以期为益生菌功能性食品的开发及贮藏提供理论依据。食品化学 食品科学 202
20、3,Vol.44,No.16 831 材料与方法1.1 材料与试剂MRS肉汤、MRS固体培养基 北京奥博星生物技术有限公司;SHMP 天津德恩化学试剂有限公司;GE(动力160)郑州天顺食品添加剂有限公司;TGase(120138 U/g)江苏一鸣生物股份有限公司;氯化钠 江苏强盛功能化学股份有限公司;植物乳杆菌由实验室保藏。1.2 仪器与设备TM3030Plus扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)日本日立高新技术公司;NIMl20-015V-1-I型低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NM
21、R)成像分析仪 上海纽迈电子科技有限公司;DHR-2型流变仪 美国Waters公司;DSC-1型差示扫描量热仪 瑞士Mettler-Toledo公司;VERTEX70型傅里叶变换中远红外光谱(Fourier transform mid-and far-infrared spectroscopy,FTIR)仪 德国Bruker公司;TA.XT Express食品物性分析仪 英国Stable Micro Systems公司;荧光分光光度计 美国Aglient Cary Elipse公司;恒温磁力搅拌水浴锅 常州诺基仪器有限公司;微波真空冷冻干燥机由实验室自制。1.3 方法1.3.1 菌悬液的制备将
22、80 贮藏的植物乳杆菌冻存液,按2%的接种量接种于MRS培养基中,传代培养23 代后,收集培养至稳定期前期的菌液,4、5 000 r/min离心10 min,并重新悬浮于无菌NaCl溶液(0.75 g/100 mL)中,采用平板稀释涂布计数法测定该悬浮液的菌落总数,使其平均菌落总数在110811010 CFU/mL左右,放入4 左右的冰箱中备用。1.3.2 复合水凝胶包埋体的构建磷酸化GE的制备参照Cen Shijie等10的方法,在40 的水浴条件下,将3.5 g/100 mL的GE溶液以一定转速搅拌20 min使其溶解后,按GE/SHMP为351加入SHMP,继续搅拌使GE和SHMP充分混
23、合均匀,此时溶液形成稳定的乳化液。在持续搅拌下向溶液中滴加10%醋酸溶液于乳化液中,调节溶液pH 4.8,使GE和SHMP交联形成初级水凝胶,反应30 min后,将其置于4 的冰箱中静置过夜。复合水凝胶包埋体系的构建参照Yan Wenjia等18的方法,在40 水浴条件下,将上述制备的水凝胶以一定转速搅拌并以水凝胶-菌液(1 4,V/V)的比例加入浓缩菌液,同时加入100 L的吐温-80作为乳化剂,搅拌10 min使菌液被充分吸附在凝胶网络中,加入TGase(5 U/g(底物为GE),40 温水浴搅拌2 h后收集湿微胶囊进行分析。1.3.3 凝胶强度测定将GE、GE/SHMP、GE/SHMP/
24、TGase水凝胶及包埋体鲜样倒入凝胶模具中,12 h后切割成20 mm高的圆柱体,采用圆柱形探(P/0.5 R),测前速率2.00 mm/s;测试速率1.00 mm/s;返回速率1.00 mm/s,触发力5 g,压缩变形程度40%。每组样品测试3 次,取平均值作为实验结果。1.3.4 凝胶动力学测试将GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝胶及包埋体鲜样,采用直径为40 mm的平板,设定测量间距1 mm,频率为1 Hz,在2.0%的线性黏弹性范围内,首先将凝胶样品以5/min的速率从40 降至4,然后以扫描温度4,扫描时间3 600 s,测定扫描过程中的储能模量G随时间的变化,将G
25、随时间的动态变化方程拟合为胶凝动力学方程,见下式:Gt?C?Kgele?t/A 式中:Kgel为胶凝速率;t为胶凝时间;A和C为 常数。1.3.5 水分分布状态测定将GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝胶及包埋体鲜样置于核磁瓶中,于4 冰箱中贮藏12 h后,将核磁瓶放于25 cm样品管中并置于射频线圈中心。采用CPMG程序对样品进行测定,测量件如下:采样间隔时间4 000.0 ms,累加次数8,前置放大1 倍,回波个数10 000。采样结束后采用纽迈核磁共振反演软件对得到的CPMG指数衰减曲线进行反演,得到LF-NMR弛豫 时间谱图。1.3.6 热稳定性测定将GE、GE/SHM
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