基于谱效关系和成分敲除探讨独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分.pdf
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1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1833-1841基于谱效关系和成分敲除探讨独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分陈瑞鑫,康点点,詹琥珀”,蒋桂华1.3*,蒋运斌2*成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室,成都6 11137;2西南大学药学院中医药学院,重庆40 0 0;成都中医药大学民族医药学院,成都6 11137摘要:为探讨独一味总黄酮抗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的关键成分,阐明独一味治疗RA的药效物质基础,本研究建立了独一味总黄酮的指纹图谱,13批独一味总黄酮指纹图谱共标示了8 个共有峰,指认了其中3个共有峰。同时
2、基于13批独一味总黄酮样品对成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)活力的影响,建立了独一味总黄酮抗RA的谱效关系,结果表明木犀草苷和木犀草素为独一味总黄酮抗RA的关键成分。采用成分敲除技术探讨独一味总黄酮中木犀草苷成分抗RA的药效,并比较了等摩尔量木犀草苷和木犀草素对照品分别对FLS细胞活力的影响,结果表明木犀草苷和木犀草素成分均能显著抑制FLS细胞活力(P0.01),且二者抑制率无显著性差异。结合独一味总黄酮HPLC图谱中木犀草苷含量明显高于木犀草素,表明木犀草苷为独一味总黄酮抗RA 的关键成分之一,可为临床运用独一味治疗RA 提供一定的参考。关
3、键词:独一味;总黄酮;类风湿关节炎;药效物质基础中图分类号:R932D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.11.001Study on the key components of total flavonoids from Lamiophlomis Herbain the treatment of rheumatoid arthritis based on spectrum-effectCHEN Rui-xin,KANG Dian-dian,ZHAN HU-po,JIANG Gui-hua文献标识码:Arelationship and component knockout
4、1,3*,JIANG Yun-bin2*文章编号:10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-18 33-0 9 State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources,School of Pharmacy,Chengdu Universityof Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China;College of Pharmaceutical Sciences,Southwest University,Chongqing 4000,China;School o
5、f Ethnic Medicine,ChengduUniversity of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,ChinaAbstract:This study aimed to explore the key components of total flavonoids from Lamiophlomis Herba(LH)against rheuma-toid arthritis(RA),which can elucidate the active components of LH against RA.In this work,the
6、 fingerprint of 13 batches ofthe total flavonoids from LH was established,including eight common peaks,of which three were identified.Based on theeffect of 13 batches of total flavonoids from LH on the activity of fibroblast-like synoviocytes(FLS),the spectrum-effect rela-tionship was established fo
7、r the anti-RA effect of total flavonoids from LH.The results showed that luteoloside and luteolinwere key components of total flavonoids from LH against RA.Then,the component knockout technique was used to investigatethe anti-RA efficacy of the luteoloside component in the total flavonoids from LH,a
8、nd the effects of luteoloside and luteolin onFLS cell viability were compared.The results showed that luteoloside and luteolin could significantly inhibit FLS cell viability(P0.01),and there was no significant difference between their inhibition rates.Because the HPLC spectrum of total flavonoidsfor
9、m LH showed that the content of luteoloside was higher than that of luteolin,luteoloside is a key component of total flavonoids收稿日期:2 0 2 3-0 7-2 6基金项目:国家自然科学基金青年科学基金(8 2 10 452 8);重庆市自然科学基金面上项目(cstc2020jcyj-msxmX0146);国家重点研发计划(2019YFC1712302)*通信作者 E-mail:bbg ,yunbinjiang 接受日期:2 0 2 3-10-171834from
10、LH against RA.This work can provide a certain reference for the clinical application of LH in the treatment of RA.Key words:Lamiophlomis Herba;total flavonoids;rheumatoid arthritis;pharmacodynamic material basis中药独一味(Lamiophlomis Herba,LH)为唇形科植物独一味 Lamiophlomis rotata(Be n t h.)K u d o的干燥地上部分,系藏族习用药
11、材,也常作中药使用。中华人民共和国药典2 0 2 0 年版载其具有活血止血、祛风止痛的功效,可用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、黄水病 。其藏药名“大巴”“打布巴”先后记载于藏医著作月王药诊四部医典晶珠本草等,迄今已有12 0 0 年的应用历史2 ;晶珠本草中记载“独一味,固精髓,引流黄水”3,表明独一味可应用于“黄水病”的治疗。而根据临床表现,藏医记载的“黄水病”可归属于中医学“痹证”范畴,由“痹证”发展而来的“骨痹”、“历节病”等与现代医学中“类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)”临床特征性表现更为贴近4。因此,独一味具有治疗RA 的潜力5,现有研究也表明了独一味具有抗
12、RA的药效6 8 RA是一种以慢性、多发性关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病,其病理特点表现为滑膜细胞“肿瘤样”增生以及血管的形成,其中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是其主要的效应细胞9。目前,RA的发病机制尚不明确,其发病率和致残率均较高,且通常潜伏发病,疾病晚期可能导致不同程度无法逆转的残疾,属世界卫生组织规定的现代难治病10 。临床上常用于治疗 RA 的化学药物如非留体抗炎药、免疫抑制剂、糖皮质激素和生物制剂,前3种化学药物不良反应明显,而生物制剂昂贵的价格限制了其长期应用1。故开发临床新型低副作用且疗效稳定的抗RA药物显得尤为必要。
13、课题组前期首次采用网络药理学对独一味抗RA的药效物质基础和作用机制进行了探讨,发现独一味对RA的治疗作用与其2 3种成分相关,其中黄酮类成分数量占比接近40%,提示黄酮类成分在独一味抗RA的过程中发挥了重要作用,尤其是木犀草素;并提出独一味抗RA的主要机制可能是通过抑制PI3K-Akt信号通路诱导滑膜细胞凋亡12 。同时,通过大鼠佐剂性关节炎模型对独一味抗RA的作用及药效物质基础进行了研究,结果表明独一味总黄酮具有良好的抗RA作用13。独一味总黄酮可能是其抗RA的主要药效物质基础之一,但独天然产物研究与开发一味总黄酮中抗RA的关键药效成分还不明确,呕待进一步研究。因此,本研究拟通过谱效关系和成
14、分敲除技术,对独一味总黄酮中抗RA的关键成分进行探讨,旨在为临床运用独一味治疗 RA 提供理论依据和参考。1材料与方法1.1实验材料1.1.1药材及样品制备13批不同产地独一味药材样品信息见表1,所有样品经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为唇形科植物独一味Lamiophlomis rotata(Be n t h.)Kudo的干燥地上部分。独一味总黄酮样品的制备:取独一味药材粉末100g加人渗滬桶中,加人95%乙醇水没过粉末,静置2 4h后开始提取。95%乙醇水适当流速渗滬,收集渗滬液,于50 减压旋转蒸发回收溶剂,待回收至约30 mL时将浓缩的渗滬提取液与预处理的聚酰胺粉拌匀,在50 C水浴
15、蒸干,上样于已处理好的聚酰胺色谱柱,放置2 4 h。先以高纯水(3倍柱体积)洗脱至无色,然后用7 0%乙醇水溶液(14倍柱体积)洗脱,并收集7 0%乙醇水洗脱液,减压浓缩,即得独一味总黄酮。基于该方法课题组制备得到的13批独一味总黄酮纯度范围在55.8 2%94.12%,纯度平均值为8 0.6 2%。1.1.2仪器Ultimate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司);KQ-500VDE双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XSP-37XB倒置生物显微镜(上海民仪电子有限公司);SYNERGYH1BioTek多功能微孔板检测仪(安捷伦科技有限公司);ZF-90紫外分析仪(温
16、州奥利生物医学仪器厂)。1.1.3试剂与试药色谱纯乙腈(美国TEDIA公司);色谱纯甲酸(成都市科隆化学品有限公司);超纯水;分析纯甲苯、甲酸乙酯、甲酸、三氯化铝(成都市科隆化学品有限公司);二甲基亚矾(河北品科研生物科技有限公司);Fetal Bovine Serum血清(天杭生物有限公司);DMEM高糖培养基(武汉塞维尔生物科技有限公司)。Vol.35Vol.35对照品木犀草苷(批号MUST-21111817)、木犀草素(批号:MUST-21072311)、绿原酸(批号:MUST-样品批次Sample numberS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13陈瑞鑫等:基于谱
17、效关系和成分敲除探讨独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分青海省海南藏族自治州三智藏西医综合诊所西藏自治区拉萨市曲水县西藏自治区拉萨市达孜县区四川省阿坝藏族自治州阿坝县四川省甘孜藏族自治州石渠县德荣玛乡四川省甘孜藏族自治州石渠县虾扎镇四川省甘孜藏族自治州色达县云南省迪庆藏族自治州德钦县云南省迪庆藏族自治州香格里拉市183521070910)购自成都曼思特生物科技有限公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。表1独一味样品信息Table 1 Sample information of LH采集地或购买地Collection or purchase location青海省玉树藏族自治州杂
18、多县青海省玉树藏族自治州玉树市青海省黄南藏族自治州泽库县青海省果洛藏族自治州久治县收集时间Collection time2021.08.032021.08.042021.08.072021.08.072021.08.082021.07.202021.07.252021.07.272021.08.132021.08.142021.07.282021.08.172021.08.201.1.4实验细胞人滑膜组织由中山大学附属第一医院风湿免疫科肖游君副主任医师提供,其取自正在接受膝关节滑膜切除术或全膝关节置换术的活动期RA患者(患者年龄在356 8 岁之间);中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准了本
19、研究中涉及的所有研究方案(No.2017-049)。将取自RA患者的滑膜组织精细切成小片,用胶原酶(1 mg/mL)在37 消化3 h,终止消化后,分离FLS 细胞,将其置于10%FBS(胎牛血清)的 DMEM 高糖培养基于5%CO2、37 恒温培养箱中培养。1.2实实验方法1.2.1独一味总黄酮指纹图谱的建立1.2.1.1包色谱条件Waters Symmetry Cis色谱柱(4.6 mm 250mm,5m);流动相A为乙腈,流动相B为0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱(0 15 min,8%13%A;15 25 min,13%A;25 35 min,13%17%A;35 55min,17%A;5
20、5 70 min,17%38%A;70 80min,38%A);检测波长为2 45nm;流速为1.0 mL/min;柱温为2 9;进样量为10 L。1.2.1.2供试品溶液的制备取13批独一味总黄酮样品各0.1g,精密称定,置于2 5mL容量瓶中,加甲醇超声溶解,定容,混匀,过滤,取续滤液过0.2 2 m微孔滤膜即得。1.2.1.3对照品溶液的制备精密称定木犀草苷、木犀草素、绿原酸对照品3mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇配置成0.3mg/mL的对照品溶液,摇匀过0.2 2 m滤膜,即得。1.2.1.4?方法学考察精密度考察:取独一味总黄酮样品(S1),按“1.2.1.2”项下方法制备供试品
21、溶液,按1.2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次,并记录HPLC图谱。重复性试验:取独一味总黄酮样品(S1)6份,按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1.1”项下色谱条件进样分析,并记录HPLC 图谱,考察该方法的重复性。稳定性试验:取独一味总黄酮样品(S1),按“1.2.1.2”项下供试品溶液制备方法,分别于制样后0、2、4、8、12、2 4h按“1.2.1.1”项下色谱条件记录HPLC图谱,考察样品稳定性。1.2.2独一味总黄酮对RA-FLS 细胞活力的影响1.2.2.1样品的制备取不同批次独一味总黄酮样品,使用前溶解于DMSO中,再配制成所需浓度的含药细胞培养液。1
22、.2.2.2细胞培养与分组RA-FLS 细胞的分离、培养与鉴定参照已有研究方法14.15,设不含细胞和药物的空白组、含细胞不1836含药物的对照组和不同批次独一味总黄酮给药组(6 4 g/mL),采用显微镜观察细胞生长状态,将生长良好的FLS 细胞进行计数,并采用DMEM高糖培养基调整细胞密度为510 4个/mL,将悬浮好的细胞,以每孔10 0 L接种于96 孔培养板进行培养。给药组加人对应浓度的独一味总黄酮,空白组和对照组加入等体积的含DMSO培养液。1.2.2.3独一味总黄酮对RA-FLS细胞活力的影响待细胞生长贴壁,弃去培养基,用0.1%DMSO溶解独一味总黄酮,使其在加人细胞培养孔后的
23、浓度为6 4 g/mL,每孔10 0 L,孵育48 h后,每孔加人10 LCCK-8试剂,置于5%COz、37 恒温培养箱中2 h。使用多功能微孔板检测仪在450 nm波长测定吸光度,按照公式(1)计算细胞活力。细胞抑制率=(A对照-A试验)/(A对照-A空白)10 0%其中,A对照为细胞未经药物处理组的吸光度值,A试验为细胞经药物处理组的吸光度值,A空白为空白组,即无细胞、无药物组的吸光度值。1.2.2.4数据分析方法采用SPSS软件进行数据分析,数据以均数标准差(s)表示,服从正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用LSD,当P0.05表示差异具有统计学意义。1
24、.2.3独一味总黄酮抗类风湿关节炎谱效关系的建立将独一味总黄酮指纹图谱共有峰峰面积和对应FLS细胞活力抑制率数据组成原始数据矩阵,进行灰色关联度分析和偏最小二乘回归分析,建立独一味总黄酮抗类风湿关节炎的谱效关系。1.2.4基于成分敲除研究独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分在基因敲除模式的影响下,成分敲除技术被逐天然产物研究与开发渐引人到中药药效物质基础的研究中,该技术具有明显的中医药特色,可将中医药理论的整体观、系统观运用于实际并突显中医药多成分协同抗的丰富内涵16 。木犀草素为木犀草苷的糖苷元,可能是由于天然黄酮类成分常以苷类形式存在17 ,独一味总黄酮HPLC图谱中木犀草苷含量明显高于木
25、犀草素。基于此,本研究拟采用薄层敲除法对独一味总黄酮中木犀草苷成分进行成分敲除,考察木犀草苷是否为独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分。1.2.4.1对照品溶液的制备取木犀草苷对照品0.4mg,精密称定,以7 0%乙醇水制备成含木犀草苷0.0 4mg/mL的对照品备用溶液。1.2.4.2供试品溶液的制备(1)取独一味总黄酮0.0 4g,置于10 mL容量瓶中,加7 0%乙醇水溶解,摇匀,作为供试品溶液。1.2.4.37薄层色谱条件展开剂选用甲苯:甲酸乙酯:甲酸(2:4:1),显色剂应用5%的三氯化铝乙醇溶液,在紫外光灯(36 5 n m)下对木犀草苷予以鉴定。1.2.4.4敲除样品的制备用注射
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