基于网络药理学的余甘子有效部位调控巨噬细胞极化机制研究.pdf
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1、2622Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期基于网络药理学的余甘子有效部位调控巨噬细胞极化机制研究陈尹心,常子豪,胡倩,刘宇琦,高晔,黄雅,雒晓卫,王树楷,周立鹏,王保锦,王朝慧,崔艺彤,刘越*,张兰珍*(北京中医药大学中药学院,北京102488)摘要:目的筛选余甘子鞣质调控巨噬细胞极化的活性部位,探讨其调控巨噬细胞极化的主要化学成分和作用机制。方法采用 CCK-8 细胞增殖实验检测细胞活力;荧光定量 PCR(qPCR)检测 M2 巨噬细胞标志物 Arg-1、CD206、T
2、NF-mRNA 表达水平以筛选有效部位;UPLC-Q-Exactive-MS/MS 表征其化学成分。利用 SwissADME 和 SwissTargetPrediction数据库筛选活性成分并获取其对应靶点,与 GEO 数据库中筛选的 M1-M2 型巨噬细胞差异基因取交集,运用 Cytoscape 3.7.2 软件绘制“药物成分-潜在靶点”网络图,并在 STRING 数据库进行蛋白互作关系分析,并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果基于体外巨噬细胞极化模型,发现余甘子鞣质 20%甲醇洗脱部位可显著抑制 M2巨噬细胞标志物 Arg-1 和 CD206 mRNA
3、 的表达,升高 M1 巨噬细胞标志物 TNF-mRNA 的表达(P 0.001),且活性明显强于其他洗脱部位。通过比对余甘子鞣质与 20%甲醇洗脱部位UPLC-MS总离子流图,鉴定出 20%甲醇洗脱部位中化学成分 29 个,筛选出有效成分 11 个,对应靶点 94 个,药物-巨噬细胞相关交集靶点 37 个;KEGG 富集分析结果显示,余甘子鞣质 20%甲醇洗脱部位调控巨噬细胞极化相关靶点主要为 HIF-1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、NF-kappaB信号通路等,涉及有机物的反应、对含氧化合物的反应、对化学刺激的细胞反应等显著相关生物过程。结论本研究基于巨噬细胞极化模型筛选出余甘子鞣
4、质中调控巨噬细胞极化的主要活性部位,借助网络药理学初步证明了余甘子鞣质 20%甲醇洗脱部位可以多成分、多靶点、多通路共同调控巨噬细胞极化,为进一步阐明余甘子鞣质调控巨噬细胞极化的药效物质和作用机制提供依据。关键词:余甘子;鞣质部位;巨噬细胞;UPLC-Q-Exactive-MS/MS;网络药理学中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1672-2981(2023)10-2622-08doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.012Regulation of macrophage polarization by effective part of Phyl
5、lanthus emblica L.and related mechanism based on network pharmacology CHEN Yin-xin,CHANG Zi-hao,HU Qian,LIU Yu-qi,GAO Ye,HUANG Ya,LUO Xiao-wei,WANG Shu-kai,ZHOU Li-peng,WANG Bao-jin,WANG Zhao-hui,CUI Yi-tong,LIU Yue*,ZHANG Lan-zhen*(School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medi
6、cine,Beijing 102488)Abstract:Objective To screen the effective part of tannins in Phyllanthus emblica L.that can modulate macrophage polarization and to determine its major chemical constituents and mechanism.Methods The cell vitality was detected by cell counting kit-8(CCK-8).qPCR experiments were
7、conducted to detect the mRNA expression of Arg-1,CD206 and TNF-to screen the effective part;UPLC-Q-Exactive-MS/MS was used to identity the chemical compositions.SwissADME,SwissTargetPrediction,and GEO database were used to obtain the active components and potential targets in the regulation of macro
8、phags.Component-potential targets network was established with Cytoscape 3.7.2.The protein interaction was analyzed with STRING database.Gene ontology(GO)functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)基金项目:科技部重大专项重大新药创制项目(No.2018ZX09711001-003-025);国家自然科学基金面上项目(No.81
9、274187)。作者简介:陈尹心,女,在读硕士研究生,主要从事药效物质基础及药理作用研究,email:*通信作者:张兰珍,女,研究员,主要从事中药药效物质与质量控制研究,email:;刘越,男,讲师,主要从事中药药效物质基础及质量控制研究,email:liuyuebei_2623中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞。一般来说,在不同生理病理因素刺激下,巨噬细胞可分化成两种极化状态,即经典活化的 M1 型和替代活化的
10、M2 型。其中,M1 型参与促炎反应的同时也发挥抗肿瘤活性,而 M2 型则参与抗炎反应,并能通过肿瘤免疫抑制等作用促进肿瘤发展。调控 M2 型巨噬细胞向M1 型极化能够增强肿瘤免疫反应、抑制肿瘤生长、转移和肿瘤血管生成1。因此,调控肿瘤相关巨噬细胞极化已经成为一种多机制、多功能的高效免疫治疗策略。余 甘 子 为 大 戟 科 叶 下 珠 属 植 物 余 甘 子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实,具有清热凉血、消食健胃、生津止咳之功效2。现代研究表明,余甘子主要含有酚酸类、鞣质类成分。课题组前期研究发现余甘子鞣质在体外能诱导人肝癌细胞 BEL-7402 早期凋亡和 G2/M
11、期阻滞3,通过调节 MAPK 通路,降低 MPPs 的表达,诱导肿瘤细胞凋亡4。临床研究表明余甘子鞣质具有潜在的免疫调节作用5。但其是否具有重塑免疫抑制微环境抑制肿瘤生长的作用以及其物质基础和作用机制尚不清楚。因此,本研究以M2 型巨噬细胞为对象筛选抑制 M2 型巨噬细胞极化调节肿瘤微环境的余甘子活性部位,并结合UPLC-Q-Exactive-MS/MS技术和网络药理学分析其物质基础和作用机制。1材料1.1仪器超高效液相色谱仪和 Q-Exactive 高分辨质谱仪、CO2细胞培养箱、超低温冰箱(Thermo Scientific 公司);十万分之一分析天平(Sartorius公司);KQ-50
12、0DE 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);超净工作台(北京半导体设备一厂);DT5-6A 型台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);PCR 扩增仪(德国 Eppendorf 公司);QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 仪(CFX 96,Biorad 公司)。1.2试药乙腈、甲酸(质谱纯,Thermo Fisher 公司);蒸馏水 屈臣氏集团(香港)有限公司;MCI小孔吸附树脂(日本三菱化学公司);胎牛血清、DMEM培养基(Biological Industries公司);RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及 SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物
13、科技股份有限公司);重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)、重组小鼠白细胞介素-13(IL-13)(PeproTech公司);余甘子鞣质部位(江西青峰药业有限公司)。1.3细胞小鼠 RAW264.7 单核巨噬细胞(北京协和细胞库)冻存于北京中医药大学中药学院细胞平台。细胞复苏后在含有 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中,于 37,5%CO2 的恒温培养箱中培养。2方法与结果2.1余甘子鞣质不同洗脱部位对 RAW264.7 细胞活性的影响2.1.1样品的制备取余甘子鞣质部位(鞣质含量 58%),加去离子水使溶解,经 MCI小孔树脂柱色谱吸附,依次用不同浓度的甲醇(20%、pathways enri
14、chment analysis were conducted.Results Based on the M2 macrophage cell model,the 20%methanol eluted part of tannins in Phyllanthus emblica L.significantly inhibited the mRNA expression of Arg-1 and CD206 and promoted the mRNA expression of TNF-(P 0.001),as compared with other eluted parts.Totally 29
15、 components in the 20%methanol elution were identified,11 active components,94 targets and 37 drug disease intersection targets were screened.KEGG enrichment analysis indicated that mainly PI3K-Akt signaling pathway,HIF-1 signaling pathway and NF-Kappa B signaling pathway were involved.The main biol
16、ogical processes related to GO enrichment analysis included responses to organic substances,cellular responses to organonitrogen compounds and cellular responses to chemical stimulus and so on.Conclution The 20%methanol eluted fraction of tannins in Phyllanthus emblica L.can act together in multiple
17、 components,multiple targets and multiple pathways to modulate macrophage polarization,which provides a reference for further research on the material basis and mechanism of the effect of tannins in Phyllanthus emblica L.on the regulation of macrophage polarization.Key words:Phyllanthus emblica L.;t
18、annin;macrophage;UPLC-Q-Exactive-MS/MS;network pharmacology2624Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期30%、40%、50%、100%)梯度洗脱,每步洗脱至洗脱液近无色时更换为下一洗脱梯度。合并相同洗脱液,低温浓缩,干燥成粉。2.1.2CCK-8 法检测细胞增殖将 RAW264.7 细胞铺于 96 孔板中,用不同浓度的不同余甘子鞣质洗脱部位(5、10、20、40、80、160、320 gmL 1)100 L培养 2
19、4 h后,加入 CCK-8 试剂,检测各孔吸光度值(OD值),计算细胞存活率:细胞存活率(%)(实验组 OD值空白组 OD值)/(对照组OD值空白组 OD值)100%。结果见图 1,当药物质量浓度 40 gmL 1,对 RAW264.7 细胞存活率均在 85%以上,无明显抑制作用,说明质量浓度 40 gmL 1时对巨噬细胞无明显细胞毒作用。因此,本研究选取 40 gmL 1的浓度用于后续对不同洗脱部位筛选的研究。图 1不同质量浓度的余甘子鞣质对巨噬细胞活性的影响(n 3)Fig 1Effect of different concentration of tannins in Phyllanth
20、us emblica L.on the proliferation of RAW264.7 cells(n 3)2.1.3qPCR实 验 检 测 M2 巨 噬 细 胞 中 Arg-1、CD206、TNF-mRNA表 达 将 RAW264.7 细 胞接种于 12 孔板中,不进行 M2 型诱导的为空白组(ctrl组)、用 IL-4 和 IL-13 诱导而不给药干预的为 M2 组,用 IL-4 和 IL-13 诱导后余甘子鞣质不同洗脱部位干预 24 h为给药组,收集细胞,提取RNA,逆转录 cDNA,进行 qPCR检测。设计合成Arg1、CD206、TNF-基因引物,以 Hprt1 为内参,设置反应
21、程序,目标基因的表达水平用 2 Ct比较法进行评估,结果见图 2。模型组 RAW264.7细胞表达更高水平的 Arg-1 和 CD206(P 0.05,P 0.0001),表明 IL-4 和 IL-13 作用后成功诱导巨噬细胞向 M2 型极化。各个洗脱部位对 M2 型标志基因的 mRNA表达均有一定的抑制作用。除100%甲醇洗脱部位外,不同的洗脱部位对 Arg-1的表达均有抑制作用,其中 20%甲醇洗脱部位具有极显著的抑制作用(P 0.001)。同样的,20%甲醇洗脱部位显著降低 CD206 mRNA的表达,升高 TNF-mRNA的表达(P 0.001),其调控巨噬细胞极化的活性明显强于其他洗
22、脱部位,是余甘子鞣质调控巨噬细胞极化的主要活性部位(EFP)。因此,接下来对 20%甲醇洗脱部位所含化学成分进行进一步研究。图 2余甘子鞣质不同洗脱部位对 M2 巨噬细胞极化的影响(n 3)Fig 2Effect of different elution parts of tannins in Phyllanthus emblica L.on the polarization of M2 macrophages(n 3)注:与空白组比较,#P 0.05,#P 0.0001;与 M2 组比较,*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001。Note:Compared with the ctrl
23、 group,#P 0.05,#P 0.0001;compared with the M2 group,*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001.2.1.4统计学方法结果采用 Graphpad prism 8.4.3 软件进行统计分析,各组间的比较采用单因素方差分析,所有数据以平均值 标准差(xs)表示,以 P 0.05 为差异有统计学意义。2.2UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析条件2.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱:ACE Excel 3 C18-PFP(150 mm4.6 mm,3 m);流动相:0.1%甲酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0 3 min,6%12%
24、B;3 18 min,12%20%B;18 28 min,20%30%B;28 30 min,30%B;30 34 min,30%95%B);流速:0.5 mLmin 1;进样量:5 L;柱温:30。2625中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 2.2.2质谱条件配有热喷雾离子源(HESI),负离子模式检测,离子源参数设置如下:毛细管和辅助气体加热器温度分别为 300 和 350;喷雾电压为 3.2 kV;鞘气(N2)流量为 35 arb,辅助气体(N2)流量为 15 arb
25、。归一化碰撞能量(NCE)为 35 V。在 Full-MS/dd-MS2条件下,扫描范围为 m/z 100 1500。采用 Xcalibur 3.0 软件进行数据分析。2.2.320%甲醇洗脱部位化学成分分析采用上述分析条件,对 20%甲醇洗脱部位的化学成分进行定性分析。在负离子模式下 20%甲醇洗脱部位总离子流图如图 3 所示。通过参考相关文献6-14、对比保留时间、精确质谱信息等,对 EFP 的化学成分进行确认,鉴定出 29 个可能的化学成分,包括 7 个酚酸类、12 个简单没食子酰类、9 个鞣花鞣质类、1 个其他类。UPLC-Q-Exactive-MS/MS 数据见表 1。图 3负离子模
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