![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
基于宏基因组学测序技术分析3个轮次高温大曲微生物群落.pdf
《基于宏基因组学测序技术分析3个轮次高温大曲微生物群落.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基于宏基因组学测序技术分析3个轮次高温大曲微生物群落.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、220 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程基于宏基因组学测序技术分析3 个轮次 高温大曲微生物群落王国峥,陈 笔,卢建军,陈良强,张巧玲,罗 寒*(贵州茅台股份有限公司,贵州省酿酒工程技术研究中心,贵州 遵义 564501)摘 要:使用宏基因组测序技术对3 个轮次大曲微生物群落进行解析,获取其群落结构及功能组成,旨在为提升大曲发酵质量提供理论依据。结果表明:25 个大曲测序样品平均组装长度为100.5 Mb,共检测到基因目录 43.9万 个,鉴定出5 104 个物种。物种注释结果显示,Kroppenstedtia eburnea为优势菌种,多种芽孢杆菌共同为亚优势种,下沙与
2、1轮次群落多样性水平无显著差异,造沙群落多样性高于其他轮次;功能基因注释结果显示,大曲中最丰富的是代谢相关基因,其中最具代表为碳水化合物代谢与氨基酸代谢;3 个轮次中,造沙大曲糖苷水解酶相关基因数最多且相关酶活力最高。上述结果表明,3 个轮次大曲群落结构与功能组成基本一致,但在功能表现上造沙与其余2 个轮次存在差异。关键词:高温大曲;酱香型白酒;宏基因组;微生物群落Analysis of Microbial Communities in Three Rounds of High-temperature Daqu Using Metagenomic TechnologyWANG Guozheng
3、,CHEN Bi,LU Jianjun,CHEN Liangqiang,ZHANG Qiaoling,LUO Han*(Kweichow Moutai Distillery Co.Ltd.,Kweichow Brewing Engineering Technology Center,Zunyi 564501,China)Abstract:Metagenomic sequencing technology was used to analyze the microbial community structures and functional composition in three round
4、s of Daqu.The results showed that the average assembly length of the 25 samples was 100.5 Mb,a total of 439 000 gene catalogs were detected,and 5 104 species were identified.The results of species annotation showed that Kroppenstedtia eburnea was the dominant species,and the subdominant species were
5、 multiple Bacillus species.There was no significant difference in microbial community diversity between samples from the first feeding(Xiasha)and those from the first round of fermentation,and the-diversity of the microbial community in samples from the second feeding(Zaosha)was higher than that in
6、samples from Xiasha and the first round of fermentation.The results of gene functional annotation showed that the most abundant genes in Daqu were related to metabolism,while the most representative genes were related to carbohydrate metabolism and amino acid metabolism.The number of glycoside hydro
7、lase genes in Zaosha samples was largest and the activities of related enzymes were highest.The above results indicated that the microbial community structures and functional composition in the three rounds of Daqu were basically consistent,whereas there was a difference in functional performance be
8、tween the Zaosha samples and the other two samples.Keywords:high-temperature Daqu;Jiang-flavor baijiu;metagenomics;microbial communityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220804-054中图分类号:TS261.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)16-0220-08引文格式:王国峥,陈笔,卢建军,等.基于宏基因组学测序技术分析3 个轮次高温大曲微生物群落J.食品科学,2023,44(16):220-227.DOI:
9、10.7506/spkx1002-6630-20220804-054.http:/WANG Guozheng,CHEN Bi,LU Jianjun,et al.Analysis of microbial communities in three rounds of high-temperature Daqu using metagenomic technologyJ.Food Science,2023,44(16):220-227.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220804-054.http:/收稿日
10、期:2022-08-04第一作者简介:王国峥(1994)(ORCID:0000-0003-1920-4380),男,助理工程师,硕士研究生,研究方向为白酒酿造微生物。E-mail:*通信作者简介:罗寒(1983)(ORCID:0000-0001-7948-3778),男,助理工程师,学士,研究方向为白酒酿造与品质。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.16 221曲是我国传统白酒酿造的重要原料,曲研究对于酿酒乃至整个传统酿造行业都有十分重要的意义1-2。酱香型白酒风味复杂,这与其发酵过程中曲用量高密切 相关2,其生产可分为下沙、造沙、17轮次,每个轮次都需要添加大量曲
11、粉作为糖化剂与发酵剂,但各轮次生产因所处的环境气候不同可能导致大曲微生物群落结构与功能出现差异3。下沙、造沙轮次是酱香型白酒生产的投粮阶段,高粱糊化程度较低4,1轮次在9 个轮次中环境均温最低、环境湿度最低5,这些不利因素都会阻碍发酵进程,因此大曲的功能在前期轮次的生产中更为重要,不仅直接决定发酵的进程,也关系到后期轮次微生物代谢产物、前体物质及香味物质的积累与形成6。因此本研究选取这3 个生产轮次的生产用曲作为实验对象,进行微生物群落结构及功能分析。随着现代分子生物学技术的发展,高通量测序技术逐渐被用于食品微生物的研究中7-8,旨在全面揭示微生物群落结构与功能信息。目前对酿造微生物菌群结构及
12、功能研究大多采用扩增子测序技术9-15,例如Wang Li等15 利用16S rRNA扩增子测解析茅台酒发酵过程中细菌群落动态变化。然而扩增子测序得到的分子信息较为简单16,难以精细解析大曲微生物群落特征,而宏基因组学测序技术则是通过获取样品中全部基因序列解析微生物群落信息方法,可以准确获取大量生态信息数据。宏基因组测序已成为研究微生物多样性和群落特征的重要手段17,相比于高通量测序技术,宏基因组测序技术可以更为全面挖掘出微生物基因组信息,便于研究者挖掘菌群的生物多样性、群落结构、功能特性和相互关系18。现已有一些学者将宏基因组测序应用于酿造微生物群落的研究当中18-23,其中也可见一些高温大
13、曲的研究,例如 Fan等18利用宏基因组测序技术对汾酒大曲进行全面解析,发现乳酸菌是群落中的主要物种,而酿酒酵母仅为群落总数的0.005%,Yang Yang等19通过宏基因组测序技术解析了中温大曲发酵过程中微生物群的分类和功能谱。目前还鲜有学者利用宏基因组测序技术对不同轮次的高温大曲群落进行比较研究,导致对高温大曲微生物群落的认识的短缺。因此本研究基于宏基因组学技术对3 个轮次(下沙、造沙、1 轮次)高温大曲群落进行精细解析,挖掘其群落结构与功能,并对不同轮次大曲间结构和功能差异进行分析,旨在为高温大曲的品质提升及生产优化提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂大曲样本于2021202
14、2年在贵州茅台酒厂采集,参考并优化麻颖垚等23-24采样方法,分别在下沙(XS)、造沙(ZS)、1轮次(YLC)取得25 个大曲样本,其中下沙轮次7 个(采样时间为10月5日10月30日),造沙轮次9 个(采样时间为11月10日12月10日),1轮次9 个(采样时间为12月25日1月20日),装入无菌自封袋中。样品采集之后置于冰盒回实验室后迅速放 入80 冰箱保存。氢氧化钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、可溶性淀粉、己酸、无水乙醇、葡萄糖 上海阿拉丁试剂有限公司;E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美国Omega BioTek公司;琼脂糖 生工生物工程(上海)股份有限公司;FastPfu Po
15、lymerase 北京全式金生物技术有限公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美国Axygen公司。1.2 仪器与设备NanoDropTM 8000超微量分光光度计、VeritiPro聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;ExperionTM全自动电泳系统 美国Bio-Rad公司;高速台式冷冻离心机 湖南湘仪仪器有限公司;MGISEQ-2000测序仪 深圳华大智造公司。1.3 方法1.3.1 大曲样品DNA提取与检测取2.0 g大曲样品置于50 mL离心管中,加入2
16、0 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),涡旋混匀10 min,然后2 000 r/min、4 离心5 min,将上清液转移至100 mL离心管中。收集到的上清液于12 000 r/min、4 离心10 min,沉淀用10 mL PBS洗涤一次,再2 000 r/min、4 离心10 min,收集沉淀,最后将收集的沉淀用1mL的PBS重悬备用。重悬的沉淀采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit进行提取,详细的实验步骤参照该试剂盒说明书,提取的DNA用50 L RNA free water溶解,经1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测浓度及纯度。按照上述
17、步骤重复提取大曲样品总DNA 3 次,将3 次提取的DNA样品混合并混匀,于80 保存备用。1.3.2 宏基因组测序文库构建:取1 g大曲基因组DNA,使用超声波仪打断,打断后的样品用磁珠进行片段选择,使得样品条带集中在200400 bp左右;修复双链cDNA末端,并在3末端加上A碱基并对连接产物进行扩增,扩增产物用磁珠进行产物纯化回收;将回收后的扩增产物变性为单链,接着在环化反应体系中充分混匀适温反应一定时间,可得到单链环形产物,消化掉未被环化的线性DNA分子后,即得到最终的文库并进行检测。DNBSEQ平台测序:检测合格文库安排上机测序(DNBSEQ),单链环状DNA分子通过滚环复制形成一个
18、包含多个拷贝的DNA纳米球,接着将得到的DNB采用高密度DNA纳米芯片技术,加到芯片上的网状小222 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程孔内,通过联合探针锚定聚合技术进行测序(送深圳华大基因测序),测序数据已上传至NCBI(项目编号:PRJNA884532)。1.3.3 大曲酶活力测定采取二硝基水杨酸法25,分别对大曲糖化酶与-淀粉酶活力进行检测。1.3.4 生物信息分析测序数据质控:剔除含有10%不确定碱基(N碱基)的reads;剔除含有测序接头序列的reads(有15 个碱基或更长区域比对到接头序列);剔除含有50%以上低质量碱基(Q20碱基)的reads。序列拼接组装
19、:使用Megahit拼接软件对Clean Data进行拼接组装,过滤掉300 bp以下的片段。非冗余基因集的构建:将所有样品的预测基因序列用CD-HIT软件进行聚类,构建非冗余基因集。将样品所有的高质量reads与非冗余基因集进行比对,统计基因在对应样品中的丰度信息从而构建geneprofile。基因预测:使用MetaGeneMark(http:/topaz.gatech.edu/GeneMark/meta_gmhmmp.cgi)对拼接结果中的contig进行基因预测,并将其翻译为氨基酸序列。基因预测是指通过对组装的基因组序列进行分析,根据已知生物的基因结构知识或数据库序列识别其所包含的基因等
20、功能区域;编码基因预测是识别基因组序列上所包含的蛋白质编码区域,通过在基因组序列上寻找开放阅读框实现。而高质量基因集Gene Catalogs则是在基因预测基础上进行去冗余操作得到。物种稀疏性曲线分析:为验证本次大曲样本数量具有足够的物种覆盖程度,从样本中随机抽取一定数量的个体,统计出这些个体所代表物种数目,并以个体数与物种数构建曲线。它可以用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度,也可以用来说明样本的取样大小是否合理。分析采用对样本进行随机抽样的方法,以抽到的样本的物种个数构建稀疏曲线,末端部分呈现上升的趋势表明抽样量不足,当曲线末端上升趋势趋于平缓时则表明采样量足够。物种注释与分析:使用软件
21、Kraken226对宏基因组数据物种注释,获得物种的表达丰度,分析不同样品或者分组间的相似或差异性。宏基因组物种分析包括物种丰度的柱状图和热图分析、多样性指数(Shannon指数)、多样性分析(Bray-Curtis距离)和线性判别分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)19。基因功能注释与分析:对非冗余基因使用软件Diamond(https:/ Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)28及碳水化合物-活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)29,并对注释结果进
22、行功能差异分析,主要包括主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)、Anosim组间(内)差异分析。2 结果与分析2.1 大曲宏基因组测序与组装质量分析本次宏基因组测序共25 个样品,平均组装长度为100.5 Mb,共检测到的基因目录为438 720 个。表1是对大曲样本测序数据进行组装分析以及基因预测和去冗余后的结果,显示随着轮次的进行,大曲样本的组装总长、基因数及去冗余基因数呈现递增趋势。表 1 大曲测序数据组装以及基因集结果统计Table 1 Statistics of sequencing data and gene assembly of
23、microbial community in Daqu样本组装总长/Mbcontig N50/bpreads利用率/%预测基因数/个去冗余后基因数/个XS82.64 2 37065.64 125 36898 134ZS102.36 2 26563.79 145 890115 267YLC116.50 1 62352.21 167 462130 567平均100.502 08660.55 146 240114 656本 次 宏 基 因 测 序 样 本 基 因 片 段 长 度 集 中 在02 000 nt范围内,短片段长度基因占据大多数(图1a);Venn图显示各轮次样本基因种类具有较大差别(图1
24、b);物种稀释曲线分析(图1c)表明3 个轮次的样本数量均具有足够物种覆盖度,说明其鉴定结果总体结果具备统计学意义,能够代表每个轮次的物种组成。0150 000250 000a225 648208 22171 59222 6696 8052 5181 0591 021135143200 000100 00050 000?/nt0?199200?499500?9991 000?1 4991 500?1 9992 000?2 4992 500?2 9993 000?4 9995 000?9 99910 000?14 999?15 000XS81 50518 369125 510128 58013
25、51662 973109 232bZSYLC生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.16 2233 0005 0004 5004 0003 500?12345678XSYLCcZS9a.大曲基因长度分布图;b.基因Venn分析图;c.物种稀释曲线图。图 1 大曲样本基因预测分析 Fig.1 Gene prediction analysis of microbial community in Daqu 2.2 大曲样本多样性分析BacillusProteusCorynebacteriumGeobacillusEnterococcusUreibacillusPseudomonasSacc
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基于 宏基 组学测序 技术 分析 轮次 高温 大曲 微生物 群落
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。