基于液相色谱-同位素稀释质谱法测定氨基酸的蛋白质定量方法.pdf
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1、第36 卷第6 期2023年12 月同位素Journal of IsotopesVol.36No.6Dec.2023基于液相色谱-同位素稀释质谱法测定氨基酸的蛋白质定量方法李永利,高艳秋,薛民杰,郝玉红,李杰(上海市计量测试技术研究院,上海市在线检测与控制技术重点实验室,上海2 0 12 0 3)摘要:为定量分析蛋白质,建立蛋白质水解液中氨基酸的液相色谱-同位素稀释质谱分析方法。蛋白质在6 mol/L盐酸溶液存在下130 水解,经Hypercarb多孔石墨碳色谱柱、0.1%全氟戊酸水溶液/乙腈流动相体系分离,选择脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸5种较为稳定的氨基酸,以其相应的稳定同位
2、素标记物为内标括号法定量,结合蛋白质的氨基酸序列信息实现对蛋白质的绝对定量。结果表明,5种氨基酸在10 10 0 0 ng/mL范围内线性关系良好(R0.995),检出限和定量限分别在0.0 2 0.07ng/mL和0.0 6 0.2 ng/mL之间,3个不同质量水平下经水解处理的回收率在9 7.0%10 2.4%之间、相对标准偏差在1.1%3.0%之间。对新型冠状病毒(新冠病毒)N蛋白人源IgG单克隆抗体有证标准物质的分析结果和新冠病毒N蛋白国家计量比对的测量结果满意,证明该方法具有足够的准确度。关键词:液相色谱-串联质谱法;同位素稀释质谱法;氨基酸;蛋白质中图分类号:TL99doi:10.
3、7538/tws.2023.youxian.013Based on Determination of Amino Acid by LC-ID-MS文献标志码:AProtein Quantitative Method文章编号:10 0 0-7 512(2 0 2 3)0 6-0 598-0 7LI Yongli,GAO Yanqiu,XUE Minjie,HAO Yuhong,LI Jie(Shanghai Key Laboratory of Online Testing and Control Technology,Shanghai Institute of Measurement and T
4、esting Technology,Shanghai 201203,China)Abstract:In order to quantitate protein,a liquid chromatography-isotope dilution massspectrometry method for the analysis of amino acids in protein hydrolysate was estab-lished.The protein was hydrolyzed at 130 i n t h e p r e s e n c e o f 6 m o l/L h y d r o
5、 c h l o r i cacid solution,and separated by Hypercarb porous graphite carbon chromatographycolumn and 0.1%perfluoropentanoic acid aqueous solution/acetonitrile mobile phasesystem.Five stable amino acids(proline,valine,leucine,isoleucine and phenylalanine)were selected for quantitative determination
6、 with their corresponding stable isotopemarkers as internal standard,and the absolute quantitative determination of protein wasachieved by combining protein sequence information.The linear relationship of the five收稿日期:2 0 2 3-0 2-2 7;修回日期:2 0 2 3-0 3-2 8通信作者:李杰第6 期amino acids is good within the rang
7、e of 10-1 000 ng/mL(R0.995),the limit ofdetection and the limit of quantification are between 0.02-0.07 ng/mL and 0.06-0.2 ng/mL,respectively.The recovery at three different levels is between 97.0%-102.4%,and therelative standard deviation is between 1.1%-3.0%.The analysis results of human IgGmonocl
8、onal antibody to nucleocapsid protein solution reference material of 2019 NovelCoronavirus and the measurement results of national metrological comparison of 2o19-nCovid nucleocapsid protein are satisfactory,which proves that the method has suffi-cient accuracy for protein determination.Key words:LC
9、-MS/MS;isotope diluted mass spectrometry;amino acid;protein蛋白质是生命体实现生理功能的直接参与者,因此研究生命体蛋白质表达模式和功能作用不仅局限于蛋白质的定性分析,临床检测、食品分析等领域对蛋白质的定量测量需求越来越强烈。常用的蛋白质定量测量方法主要有电泳法 1 、免疫法 2-3、高效液相色谱 4 和液相色谱-质谱联用法 5 等,随着质谱分析技术的发展,被认为是小分子定量金标准的同位素稀释质谱法 6-7 应用于蛋白质定量测量中,展现了准确、精密、易于溯源等特点 8-9。基于同位素稀释质谱法的蛋白质定量技术,可以将蛋白质酶解成肽段后测定
10、特征肽段进行定量,也可以将蛋白质完全水解成游离氨基酸后,测定各氨基酸含量,再根据蛋白质的氨基酸序列信息,由氨基酸含量计算得到蛋白质含量。基于肽段的定量方法具有更好的特异性,但需要设计酶解方案、合成标记的特征肽段,难以建立具有普适性的定量方法;基于氨基酸的定量方法,不仅需要获得准确的氨基酸序列信息,而且为了避免游离氨基酸和杂质蛋白、肽段水解产生氨基酸对测量结果的干扰,需要预先提纯蛋白质,但该方法易于建立测量结果的计量溯源性,实现对蛋白质的绝对定量,且可以建立适用于不同蛋白质的样品处理和仪器分析方法,和传统氨基酸分析法相比操作简单、准确度和精密度高 8 ,和基于肽段的定量方法相比通用性更强,因此应
11、用于蛋白质含量测定国际比对 10 1、蛋白质标准物质研制 1-12 和临床诊断中各种蛋白质分析的校准 13-141,建立蛋白质分析的计量溯源性。本研究采用蛋白质水解后以同位素稀释质谱法测定氨基酸含量的方式,建立可用于多种蛋白质的高准确度定量方法,方法精密、灵敏,李永利等:基于液相色谱-同位素稀释质谱法测定氨基酸的蛋白质定量方法1.2标准溶液的配制1.2.1氨基酸标准储备液为了获得更高准确度的定量结果,采用重量法配制标准溶液。分别称取Pro、V a l、Le u、I le、Ph e 标准物质约10mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并599结果可溯源至国际基本单位,可应用于蛋白质绝对定量和蛋
12、白质标准物质研制。1实验部分1.1 仪器与试剂超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪:Acquity UPLC I-Class Plus/XEVO TQ-XS型,美国Waters公司;电子天平:XPE105型,瑞士Mettler Toledo 公司;超纯水仪:Milli-Q型,德国Merck公司;水燃料氢氧机:OH200型,湖南沃克能源科技有限公司;强制对流烘箱:FD115型,德国Binder公司;冷冻干燥机:L-200型,瑞士Buchi公司。GBW(E)10 0 0 8 4脯氨酸纯度标准物质(Pro,99.01.5%,k=2)、G BW 0 92 36 L-缬氨酸纯度标准物质(Val,99.4
13、%,U,=0.6%,k=2)、GBW09237L-亮氨酸纯度标准物质(Leu,99.7%,U,=0.4%,k=2)、G BW 0 92 38 L-异亮氨酸纯度标准物质(Ile,99.7%,U,=0.3%,k=2)、G BW(E)100061苯丙氨酸纯度标准物质(Phe,9 9.0 士1.5,k=2)等2 0 种天然氨基酸纯度标准物质和GBW(E)091110新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)人源IgG单克隆抗体溶液标准物质(8 5.3士8.5g/g):中国计量科学研究院;Pro-13Cs、Va l-13C,、Le u-13C,1 N、Il e-13C。、Ph e-13C:纯度 98%,丰度 99
14、atom%,美国CIL公司;甲酸、乙腈:质谱纯,德国Merck公司;全氟戊酸:纯度 97%,德国Merck公司。600稀释至刻度,称量并记录溶液总重,得浓度约为1000g/g的氨基酸标准储备液。1.2.2氨基酸混合标准中间液分别称取Pro、V a l、Le u、I le、Ph e 储备液适量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重,得氨基酸混合标准中间液。1.2.3内标物标准储备液分别称取Pro-13Cs、Va l-13 C,、Le u-13C,1 N、Il e-13 C、Ph e-1 C,约10 mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重,
15、得浓度约为10 0 0 g/g的内标物标准储备液。1.2.4内标物混合标准中间液分别称取Pro-13 Cs、Va l-13Cs、Le u-13 C,15N、Il e-13 C、Ph e-13C。储备液适量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重,得内标物混合标准中间液。1.2.5标准工作液分别移取氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液L、10 L至样品瓶中并准确称重,冷冻干燥至干后用0.1%甲酸水溶液50 0 L复溶,得低浓度标准特征离子对基酸m/2脯氨酸11670*11643缬氨酸11872*11855亮氨酸13286*13244异亮氨酸13286*13269苯丙氨
16、酸166120*166103同位素第36 卷工作液。分别移取氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液11L、10 L至样品瓶中并准确称重,冷冻干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500L复溶,得高浓度标准工作液。1.3仪器分析条件1.3.1色谱条件Hypercarb多孔石墨碳色谱柱(10 0 2.1mm,3m);柱温40;流动相:A为0.1%(体积分数,下同)全氟戊酸水溶液,B相为乙腈;梯度洗脱:0 5min使流动相A由10 0%降至90%,510 min使流动相A由90%降至0%后保持至11.5min,再将流动相恢复至初始比例平衡1.5min;流速:0.3mL/min;进样量:2 L。1.3.2
17、质谱条件电喷雾正离子源(ESI+),毛细管电压3.0 kV,离子源温度,150,脱溶剂气流速10 0 0 L/h,脱溶剂气温度50 0,锥孔气流速150 L/h,碰撞气为氩气,多反应监测(MRM)模式。其他质谱条件列于表1,其中*为定量离子。表1氨基酸分析质谱参数Table 1MS parameters for amino acids锥孔碰撞电压/V能力/eV10121025151015161010101810101016201220特征离子对氨基酸m/脯氨酸-13Cs12174氨酸-13C12376亮氨酸-13C.15N13992异亮氨酸-13C613891苯丙氨酸-13Cg17512826
18、锥孔电压/V1015151020碰撞能力/eV12101010121.4蛋白质的水解准确称取适量样品至清洗干净的2 mL棕色安瓶,再移人内标物混合标准中间液10L并准确称重,加人6 mol/L的盐酸水溶液6 0 0 L,通氮气1min后融封,在130 烘箱中水解15h。水解后冷冻干燥至干,用0.1%甲酸水溶液50 0 L复溶,进LC-MS/MS分析。1.5蛋白质含量计算采用括号法测定各氨基酸含量,即以低浓度标准工作液-样品-高浓度标准工作液-样品-低浓度标准工作液进样测试,按公式(1)分别由各氨基酸含量计算蛋白质含量:第6 期 R,-R,C=LR,-R,CsTD msT MNm,nMAA式中,
19、C为由某氨基酸计算得到的蛋白质浓度,g/g;R,、R、R,分别为样品、低浓度和高浓度标准工作液中氨基酸和内标物的峰面积比;msTD,vm,和msTD,mi分别为低浓度和高浓度标准工作液配制时加入氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液的质量,mg;CsTD为混合标准中间液某氨基酸的浓度,g/g;msi为蛋白质水解前加人内标物混合标准中间液的质量,mg;m。为样品质量,mg;n为蛋白质中某氨基酸的数量;MAA、M N分别为某氨基酸、蛋白质的摩尔质量,g/mol。各氨基酸含量计算得到的蛋白质量分数结果,经正态性检验、一致性和等精度检验后的算术平均值或加权算数平均值即为蛋白质含量结果。2结果与讨论
20、2.1质谱条件优化用0.1%甲酸水溶液分别配制浓度为100 ng/mL的2 0 种天然氨基酸标准溶液和内标溶液,以连续流直接进样的方式注人质谱仪中进行全扫描,以响应最高的准分子离子峰质荷比作为母离子,优化锥孔电压等各质谱参数使母离子信号强度最高。再对母离子分别进行子离子扫描,选择信号强度最高且稳定的离子对作为定量离子对和定性离子对,优化碰撞能量使子离子信号强度最高。优选的质谱条件和特征离子对列于表1。1.2a1.00.80.00.40.20.01盐酸浓度/(molL-l)李永利等:基于液相色谱-同位素稀释质谱法测定氨基酸的蛋白质定量方法(msTDhmsTDmlhmlMbCRP.HSA13579
21、a盐酸浓度;b水解温度;c水解时间图1水解条件优化Fig.1 Optimization of hydrolysis conditions601mSTDi2.2色谱条件优化ml由于氨基酸极性较强,Ci8色谱柱上不易保留,分离效果不佳,常通过柱前衍生 15降低极(1)性或者使用亲水作用(Hilic)色谱柱 16 改善分离,但分析效率和分离效果难以满足蛋白质定量分析的要求。本研究结合多孔石墨化碳填料(Hypercarb)和挥发性离子对试剂,高效、准确、精密的实现了2 0 种天然氨基酸的分离分析(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、
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