基于确定性筛选设计优化五味消毒饮多成分定量指纹图谱.pdf
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1、基于确定性筛选设计优化五味消毒饮多成分定量指纹图谱江 婷,季巧遇,潘浩敏,张 尧,何 雁,饶小勇,罗晓健,(江西中医药大学,江西 南昌;江中药业股份有限公司,江西 南昌;中药固体制剂制造技术国家工程中心,江西 南昌)收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();国家科技部“重大新药创制”专项项目()作者简介:江 婷(),女,硕士,从事中药制剂研究。:,:通信作者:张 尧(),男,工程师,从事中药制剂研究。:(),:罗晓健(),男,博士,教授,博士生导师,从事中药制剂工艺、中药固体制剂研究。:(),:摘要:目的 采用确定性筛选设计建立五味消毒饮多成分定量指纹图谱分析方法。方法 采用确定性筛选设计
2、,以流动相梯度条件、体积流量、柱温为影响因素,指标成分峰分离度、对称因子为评价指标,采用逐步回归法建立评价指标与影响因素的定量模型。结果 体积流量和柱温对指纹图谱的影响为极显著(),优化后的空间范围为体积流量 ,柱温 。优化参数后的指纹图谱含共有峰 个,可用于测定紫草氰苷、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸、异绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、蒙花苷的含量。结论 该方法稳定可行,可用于五味消毒饮的指纹图谱和多成分定量检测。关键词:五味消毒饮;确定性筛选设计;指纹图谱;多成分定量检测;设计空间中图分类号:文献标志码:文章编号:():五味消毒饮源自 医宗金鉴,由金银花、
3、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子组成,主治各种疔毒、痈疮疖肿。虽有研究者报道五味消毒饮多成分定量指纹图谱检测方法,但均缺少天葵子的指标成分及蒲公英中菊苣酸的测定。因此,有必要研究一种可全面表征处方中全部饮片信息、更全面地体现五味消毒饮质量特点的指纹图谱分析方法。正交设计和响应面设计是常用的试验设计方法,但当考察因素较多时,两者的试验次数很多。而确定性筛选设计可估算所有显著因子的主效应项、主效应二次项、二阶交互作用项的系数,同时任何主要模型项之间又不会相互混淆,在多数情况下仅需较少的试验次数就可实现对多个因素的筛选和优化,能极大减少实验成本。该方法已经在化学、环境、分子生物学、药物制剂等领域得到
4、应用并取得较好结果。由于五味消毒饮成分复杂,指纹图谱分析影响因素较多,为了减少试验次数,本实验采用确定性筛选设计优化五味消毒饮多成分定量指纹图谱,以期为其质量控制和新制剂的研究提供可靠的质量分析方法。材料 仪器岛津 型高效液相色谱仪(日本岛津公司);十万分之一分析天平(瑞士梅特勒托利多公司);型纯水机(美国 公司)。试剂与药物绿原酸(批号,纯度 )、秦皮乙素(批号,纯度 )、咖啡酸(批号,纯度 )、菊苣酸(批号,纯度 )、蒙花苷(批号,纯度 )、木犀草素(批号,纯度 )、木 犀 草 苷(批 号,纯 度 )对照品均购自中国食品药品检定研究院;紫草氰苷(批号,纯度 )、格列风内酯(批号,纯度)、单
5、咖啡酰酒石酸(批号,纯度)、新绿原酸(批号,纯度 )、隐绿原酸(批号,纯度 )、异 绿 原 酸 (批 号,纯度 )、异绿原酸 (批号,纯 度 )、异 绿 原 酸(批 号,纯度)对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈为色谱纯,购自美国 公司;三氟乙酸为色谱纯,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。金银花(批号,产地山东平邑)、野菊花(批号,产地安徽六安)、紫花地丁(批号,产地河南卢氏)、蒲公英(批号,产 地 山 西 运 城)、天 葵 子(批 号,产地湖北南漳)均购自江西江中中药饮片公司,批五味消毒饮样品饮药材信息见表,经江西中医药大学刘勇教授鉴定为正品。年 月第 卷 第 期中 成 药 表 五
6、味消毒饮药材信息批号金银花野菊花蒲公英紫花地丁天葵子产地批号产地批号产地批号产地批号产地批号邢台麻城运城安国仙居邢台麻城运城安国仙居邢台麻城运城安国当阳封丘枣阳通化平邑当阳封丘枣阳通化平邑当阳封丘六安通化平邑当阳平邑六安平邑卢氏当阳平邑六安平邑卢氏当阳平邑六安平邑卢氏宜城平邑六安平邑卢氏南漳 方法与结果 对照品溶液制备 精密称取紫草氰苷、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸、异绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、蒙花苷对照品适量,置于 量瓶中,甲醇溶解并定容,摇匀,即得。供试品溶液制备 称取五味消毒饮药材(金银花 ,野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各 ),加 水煎煮
7、 ,共 次,合并滤液。按上述煎煮工艺制备五味消毒饮全味饮片、单味饮片提取液和缺野菊花、缺蒲公英、缺紫花地丁、缺天葵子的缺味饮片提取液。稀释 倍,离心,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。色谱条件 迪马()色谱柱(,);流动相乙腈()三氟乙酸(),梯度洗脱;检测波长 (指纹图谱)及、(含量测定);进样量 。试验设计 确定性筛选设计优化液相条件根据预试验结果,设定梯度条件,各梯度组成均用 三氟乙酸比例表示,梯度 比例为 ,运行;梯度 比例为 ,运行;梯度 比例为 ,运行;梯度 比例为 ,运行。以模型(紫草氰苷)、(蒙花苷)、(绿原酸秦皮乙素咖啡酸)、(菊苣酸异绿原酸 异绿原酸)色谱峰分离度和对称因子为评
8、价指标(分离度,则数值为;分离度,则数值为对称因子值或对称因子乘积值),考察流动相梯度条件()、体积流量()、柱温()等因素对分析结果的影响,采用 软件进行确定性筛选试验设计,中心点重复 次,共 次实验。因素水平见表,结果见表。数据处理与模型验证采用 软件,对确定性筛选设计数据进行方差分析,在各评价指标与影响因素之间建立定量模型,公式为 。其中,为常数,、分别为一次项、二次项、交互项的回归系数,、为各参数,为评价指标。通过校正的赤池信息量准则()结合逐步回归法简化模型,方差分析见表,可知 个模型均具有显著意义();值较高,并和(调整)值差距较小,表明模型拟合效果较好,能解释大多数变异。表 因素
9、水平因素水平梯度 运行时间 梯度 开始水相比例 梯度 运行时间 梯度 结束水相比例 梯度 运行时间 梯度 结束水相比例 梯度 运行时间 梯度 结束水相比例 体积流量()柱温 设计空间及验证 分离度和对称因子是评价色谱峰分离效果和峰形的关键指标,为了保证色谱峰定量检测的准确性,确定模型(紫草氰苷)、(蒙花苷)期望目标均为 ,(绿原酸秦皮乙素咖啡酸)、(菊苣酸异绿原酸 异绿原酸)期望目标为 。由表 可知,(体积流量)、(柱温)对各评价指标均有极显著影响(),故固定其他因素为()、()、()、()、()、()、()、(),采用 软件建立(体积流量)、(柱温)的设计空间,使得该设计空间可同时满足 个模
10、型的期望目标。为了改善设计空间边界的不确定性,加入置信水平 的置信区间来优化设计空间,见图。图中矩形范围为色谱条件影响因素空间,空间内所有影响因素的预测值均能满足期望值,设计空间为体积流量 ,柱温 。在设计空间内选取 个实验点,检测各个评价指标的值,检验模型的预测性。验证结果见表,可知实验点、预测值与实际值的偏差无显著差异,证明模型预测良好,所建立的设计空间可靠。年 月第 卷 第 期中 成 药 表 试验设计与结果试验号影响因素评价指标 表 方差分析来源回归系数回归系数回归系数回归系数模型 (调整)模型 值 年 月第 卷 第 期中 成 药 表 验证试验条件与结果试验点体积流量()柱温 数值评价指
11、标预测值 实际值 预测值 实际值 图 设计空间图 五味消毒饮指纹图谱的建立 在设计空间内选择较优色谱条件为迪马()色谱柱(,);流动相乙腈()三氟乙酸(),梯度洗脱(,;,;,;,;,);体积流量 ;柱温 ;检测波长 (指纹图谱)及、(含量测定);进样量。按“”项下方法制备 批五味消毒饮供试品溶液,在上述色谱条件下进样测定,去除因流动相梯度变化而出现的不规则色谱峰。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版)”进行数据处理,设定 样品的色谱峰为参照图谱,采用中位数法,时间窗宽度为 ,经多点校正后进行全谱峰匹配,生成五味消毒饮对照指纹图谱,见图,可知 批样品()含有 个共有峰,相似度分别为、,说明
12、各批次样品之间相似性较好。图 批五味消毒饮 指纹图谱 色谱峰的归属分析 通过对照品比对确定图 中的 号峰分别为紫草氰苷、格列风内酯、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、菊苣酸、异绿原酸、异绿原酸、异绿原酸、蒙花苷、木犀草素,并通过单味、缺味样品及对照品色谱峰保留时间进行对比,确定了共有峰归属,结果见图。其中,号峰(绿原酸)、号峰(咖啡酸)来自金银花、野菊花、蒲公英,号峰(新绿原酸)、号峰(隐绿原酸)、号峰(异绿原酸)、号峰(异绿原酸)、号峰(异绿原酸)来自金银花、野菊花,号峰(紫草氰苷)来自天葵子,号峰(单咖啡酰酒石酸)、号峰(菊苣酸)来自蒲公英,号峰(秦皮
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