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【方药研究】基于网络药理学及分子对接探讨益气疏风降肺方治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制乔阳至子1,杨道文2(1.北京中医药大学,北京 100029;2.中日友好医院,北京 100029)摘要:目的 基于分子对接技术及网络药理学来分析益气疏风降肺方治疗咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)的主要成分、潜在靶点及作用通路。方法 通过中药系统药理学数据和分析平台(TCMSP)、HERB 数据库(http:/ Genecards、Drugbank、MOIM、Disgenet 数据库检索 CVA 的相关靶点,将二者的靶点取交集,运用 Cytoscape 3.7.1 及 STRING 平台构建活性成分-靶点、蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络。借助Metascape 对共同靶点进行基因本体(gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,最后由 Autodeck Vina 1.1.2 实现主要活性成分及核心靶点的分子对接。结果发现益气疏风降肺方活性成分200 个、潜在作用靶点 619 个,CVA 相关靶点 2236 个,筛选两者共同靶点 331 个。331 个候选治疗靶点共富集到 182 条 KEGG 通路(P0.01)和 3316 个 GO 细胞生物学过程,涉及磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protien kinase,MAPK)信号通路等,与细胞的缺氧反应、炎症反应及凋亡等生物学过程有关。益气疏风降肺方中活性较强、利用度较高的关键分子包括槲皮素、鞣花酸等,分子对接显示主要活性成分与 CVA 潜在靶点具有较好的结合活性,表明本方可能通过作用于核转录因子 B(nuclear factor-kappaB,NF-B)、信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3 等关键蛋白分子,影响 PI3K-AKT、TNF、MAPK 等信号通路,从而减少炎症因子的释放、减轻气道炎性渗出、阻止气道重塑,对 CVA 起到治疗作用。结论 本研究初步揭示了益气疏风降肺方的活性成分与 CVA 发病的关键蛋白之间存在一定关系,通过多成分-多靶点-多通路的综合调控网络发挥治疗 CVA 的作用。关键词:咳嗽变异性哮喘;益气疏风降肺方;网络药理学;分子对接 中图分类号:R285 文献标识码:A 文章编号:1006-3250(2023)08-1358-07基金项目:兵团财政科技计划项目(2020AB027)作者简介:乔阳至子(1996-),女,医师,从事中医药治疗呼吸病方向研究。通讯作者:杨道文(1969-),男,副主任医师,从事中医药治疗呼吸病方向研究,E-mail:13910331107 。Mechanism of Yiqi Shufeng Jiangfei Formula in the Treatment of Cough Variant Asthma Based on Network Pharmacology and Molecular DockingQIAO Yangzhizi1,YANG Daowen2(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China)Abstract:Objective To explore the main components,potential treating targets and pathways of Yiqi Shufeng Jiangfei Formula(YSJF)in the treatment of cough variant asthma(CVA)based on network pharmacology and molecular docking techniques.Methods The TCMSP and HERB databases were used to screen the principal components and corresponding protein targets of YSJF.CVA-related targets were retrieved from Genecards,Drugbank,MOIM,and Disgenet databases.Cytoscape 3.7.1 and STRING platforms were used to construct a compound-target(CT)network and a protein-protein interact(PPI)network.Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genomes(KEGG)enrichment analysis were performed on the targets by Metascape.Finally,a molecular docking study was performed on core targets and active compounds.Results A total of 200 active compounds,and 619 potential treating targets were identified in YSJF,and 2236 CVA-related targets were retrieved.The 331 Comhon potential therapeutic targets were screened.A total of 182 KEGG pathways(P 6、betweenness 20.418、Eigenvector 0.013、LAC1、Network1.143 和 closeness0.03 进行第一次筛选,由 205 个蛋白筛选至 54 个。筛选网络图如图 5A 所示,黄色节点是筛选到的蛋白。接下来以 degree7、betweenness21.431、Eigenvector0.085、LAC3、Network4 和 closeness0.463 进行第二次筛选,由 54 个蛋白筛选得到 18 个核心靶点(图 5B),其中黄色节点则是筛选到的核心基因(图5C)。核心靶点的信息见表 4。其中,转录信号转导和转录激活因子 3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是介导炎症反应的关键分子,属于蛋白酪氨酸激酶(janus kinase,JAK)/STAT3 信号 通路,此通路是细胞固有免疫应答炎症细胞因子信号转导通路之一,可被多种因素激活进而编码一系列炎症相关蛋白,参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等病理生理过程3-4,与 CVA 的发生发展 中 具 有 强 相 关 性。丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶(mitogen-activated protien kinase,MAPK)1/3 则是细胞外调节蛋白/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路的下游因子,此通路可将细胞外信号转导入胞内,在炎症反应中发挥重要作用,可以调节炎性因子的产生、调控炎细胞的增殖分化和凋亡,慢性气道疾病的炎症机制中重要的一环5。肿瘤蛋白(tumor protein,TP)53 已被证实与迟发性哮喘的易感性有关6。16312023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese MedicineA.第一次筛选得到的网络;B.第二次筛选得到的网络;C.核心基因图 5 关键治疗靶点筛选表 4 核心靶点基本信息基因缩写对应蛋白靶点Degree 值STAT3信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription)330EP300E1A 结合蛋白 p300(E1A binding protein p300)28MYCMyc 原 癌 基 因 蛋 白(myc proto-oncogene protein)26TP53肿瘤蛋白(tumor protien)p5324ESR1雌激素受体(estrogen receptor)122HDAC1组织蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)120HSP90AA1热休克蛋白 90A1(heat shock protein 90 Alpha family class A member 1)20JUNJUN 样蛋白(jun proto-oncogene)20ATK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase)118CCND1细胞周期素(cyclin)D118HIF1A缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor)118FOS亮氨酸拉链蛋白(leucine zipper proteins)18MAPK1/3丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protien kinase)1/316/14MDM2双微体蛋白(murine double minute)214CDKN1A细胞 周 期 依 赖 激 酶 抑 制 物 1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)14RELA核转录因子 Bp65 亚单位(nuclear factor-kappa-B p65 subunit)14RB1成视 网 膜 母 细 胞 瘤 蛋 白(retinoblastoma protein)112EGFR表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)62.6 GO 和 KEGG 通路富集分析生物过程、细胞组分及分子功能本研究共富集到 182 条 KEGG 信号通路,3316个 GO 细胞生物学过程。把 KEGG 结果的前 30 条通路用气泡图展示(图 6),富集名称位于左侧,气泡红色越深表示 qvalue 越大,气泡越大 表示富集于该通路的基因越多,由图可知益气疏风降肺方的活性分子富 集 于 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶/蛋 白 激 酶 B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、MAPK、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、辅助性 T 细胞(T helper cell,Th)17 分化等通路,GO 富集结 果分别取生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cell components,CC)、分子 功能(molecular function,MF)的前 10 条目用条形图展示(图 7),可知益气疏风降肺方的 治疗作用与细胞氧化应激、铁死亡、炎症反应过程、细胞凋亡与增殖等生物学过程有关,提示益气疏风降肺方可能通过多个信号通路发挥治疗 CVA 的作用。图 6 KEGG 信号通路富集分析图 7 GO 基因功能富集分析2.7 分子对接验证选取 Degree 值靠前且与 CVA 关系较密切的基因 TP53、MAPK1、MAPK3、TNF、EGFR、STAT3 与益气疏风降肺方的主要活性物质(槲皮素、EGCG、木犀草素、山柰酚、咖啡酸、棕榈酸)进行分子对接,潜在结合能均-5 kcal/mol,可初步推断益气疏风降肺方的主要活性物质与 CVA 潜在治疗靶点具有较2631中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine 2023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8好的结合活性,具体对接的最低结合能详见表 4。其中 EGCG 与关键靶点结合活性好,对接的分子能最低,其分子对接模式图见图 8。A.MAPK1 和 EGCG 结构分子对接结果(最低结合能-9.4 kcal/mol);B.MAPK3 和 EGCG 结构分子对接结果(最低结合能-9.4 kcal/mol);C.TP53 和 EGCG 结构分子对接结果(最低结合能-9.2 kcal/mol)图 8 ECGC 与关键靶分子结合模式图表 5 主要活性物质分子与关键靶点对接最低结合能(kcal/mol)CompoundMAPK1MAPK3TNFTP53STAT3EGFR槲皮素-8.4-8.9-5.9-8.2-7.2-6.4EGCG-9.4-9.4-6.1-9.2-8.4-7.1木犀草素-8.7-6.1-7.2-8.4-8.1-7.6山柰酚-8.3-7.0-5.7-7.9-5.1-5.8咖啡酸-6.3-8.6-6.0-7.5-6.7-6.2棕榈酸-7.1-6.9-7.2-8.4-5.8-7.63 讨论本研究对益气疏风降肺方的有效成分和潜在作用靶点进行了筛选和分析,通过观察益气疏风降肺方的作用靶点和活性成分的关系网络,可以发现益气疏风降肺方的不同药味中可能有着一样的活性成分,不同成分也有可能会和同一靶点产生关系,充分体现了中药复方制剂组分丰富、靶点众多、通路复杂的机制特点。通过对益气疏风降肺方组成药物的活性成分进行研究和文献学习,发现 Degree 值较高的活性成分中,槲皮素一方面可以抑制中性粒细胞白介素(interleukin,IL)-6 的表达水平,从而在炎症早期即发挥明确的抗炎作用7,一方面还可以调节核转录因子 B(nuclear factor-kappaB,NF-B)功能,在蛋白水平和 mRNA 水平对环氧化酶 2、诱导型一氧化氮合酶、C 反应蛋白表达加以抑制8,调控机体的炎症反应。作为一种蛋白激酶抑制剂,槲皮素还能竞争性结合磷脂酰肌醇 3 激酶等腺嘌呤核苷三磷酸结合位点,使得激酶磷酸化状态得到改变,从而让其失去活性。另外,槲皮素也能够对蛋白激酶 C 的活性加以抑制,阻断 Ca2+内流进入细胞,使得炎症介质如白三烯、组胺的释放受到抑制,减轻炎症反应的发生。槲皮素还可以通过对辅助型 T 细胞 1/辅助型 T 细胞 2 稳定性调节、减少 B 细胞释放抗原特异性免疫球蛋白 E 抗体等方式在抗炎和机体的免疫功能调节中发挥重要作用9。EGCG 是一种绿茶多酚类分子,具有抗氧化、清除自由基、抗癌、增强免疫功能等方面具有生物学活性,研究证实 EGCG 可以抑制巨噬细胞凋亡,减轻免疫细胞炎症反应10。在对哮喘模型小鼠的研究中发现 ECGC 能够组织炎细胞向肺组织中募集,降低小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的表达,抑制黏液分泌、减少杯状细胞化生等,从抑制炎症过程、减轻气道重塑等多个方面气道减轻模型动物卵清蛋白诱导下的哮喘发生11。山柰酚能够对酪蛋白激酶 2 活化加以抑制,阻断支气管上皮内质网应激,从而减少呼吸道黏液分泌。山柰酚还能够对支气管上皮细胞蛋白酶激活受体的功能加以调节,抑制支气管上皮细胞转化为间质细胞,从而使得纤维化气道重塑减轻12-13。CVA 发病与病毒感染、免疫功能调节等有关14,其发生过程中伴随着炎症因子的显著升高,从而引起气道慢性炎症、高反应性、气道重塑等病理过程15,通过对主要活性成分的药理作用进行研究,可知益气疏风降肺方可以通过减少炎症因子的释放、减轻炎细胞募集过程、抑制气道黏液分泌、阻止气道重塑等方式降低气道高反应性、减少气道炎症反应、对气道重塑加以抑制,从而实现相应的治疗作用,与 CVA 发病机制相符。从核心靶点和益气疏风降肺方主要活性成分对接结果分析,推测本方活性成分可能通过调控细胞增殖与凋亡过程、胞外信号转导、免疫细胞分化、炎症因子释放等过程抑制细胞炎症、调节免疫反应、抑制气道重塑发生。其中 STAT3 是一种多功能的转录因子,和 JAK/STAT 信号通路有关,作为本方Degree 值最高的潜在靶点在许多细胞过程中起关键作用。根据动物实验的结果,IL-6 结合了细胞上的特异受体后,通过 JAK/STAT3 信号转导途径实现STAT3 的活化,进而引起 T 细胞炎症通路得到激活,STAT3 诱导还能使巨噬细胞产生抗炎症因子 IL-10,从而调节机体免疫反应16。KEGG 通路富集发现本方治疗 CVA 的关键通路包括 PI3K-AKT 信号通路、TNF 信号通路、MAPK 信号通路、Th17 细胞分化、IL-17 信号通路等。PI3K-AKT 信号通路在调节细胞存活、增殖和凋亡过程中占有重要地位,此通路36312023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine可以通过多种途径调节细胞周期,与细胞的生长、存活和凋亡密切相关,是目前抑制 CVA 患者气道重塑的研究热点17-19。TNF 信号通路不仅参与细胞周期调控,还与炎症反应和免疫反应关系密切,此通路激活后可促使 NF-B 入核,引起多种炎症因子和趋化因子的过度表达,导致炎症和免疫反应加重20。在变态反应炎症的抗原致敏方面,Th-17 阳性 T 细胞及 IL-17 发挥着重要作用21。综上,本文通过网络药理学和分子对接技术,发现益气疏风降肺方通过多通路、多靶点、多成分治疗CVA,分析了其相互作用关系,证实了益气疏风降肺方活性物质与 CVA 的核心治疗靶点具有较强的结合力,其主要活性成分槲皮素、山柰酚、EGCG、木犀草素等可通过调节 STAT3、MAPK、ESR1、ATK1、TP53 等关键靶点,干预 PI3K/AKT 信号通路、Th17细胞分化、IL-17 炎症细胞因子通路等关键生物过程,从而实现对机体的免疫反应及细胞的增殖、分化、凋亡等产生影响,调节细胞炎症反应发生发展,使得慢性炎症得到改善,并对气道重塑加以抑制,以此来实现 CVA 治疗效果。结合上面的分析成果,下一步 可 围 绕 益 气 疏 风 降 肺 方 对 于 PI3K/AKT、MAPK、IL-17 等信号通路的作用及本方对气道上皮细胞凋亡的具体影响等展开进一步研究。本研究也能够指导益气疏风降肺方的临床应用,在治疗 CVA新药物的研制方面提供一定的线索。但本研究的结果和结论受数据库信息不全、疾病靶点未得到彻底研究等问题的限制,筛选和预测的结果均存在一定的偏倚,仍需要通过进一步的临床和实验研究加以验证。参考文献:1 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