Avermectin粗粉的结晶工艺研究与杂质分析.docx

Avermectin粗粉的结晶工艺研究与杂质分析

　　 作者：刘吉 季清荣 常志东，谢智 张贵峰 申淑锋 孙兴华 雷超 刘会洲
【关键词】 Avermectin；,高效液相色谱；,质谱；,杂质；,结晶
摘要： 采用高效液相色谱(HPLC)电喷雾串级质谱(ESIMSMS)的方法对avermectin粗粉中的杂质进行定性分析。确定了主要杂质成分为：与B1a结构相类似的B1b、A1a、A1b、A2a、A2b、B2a 6个组份，其中A1a、B1b、B2a多次结晶也不易去除。随后考察了avermectin粗粉在甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮中的重结晶，甲醇和正丁醇对杂质的去除效果更好；乙醇与丙酮相当，但对杂质去除的选择性不同。
　　关键词： Avermectin； 高效液相色谱； 质谱； 杂质； 结晶
Study on the crystallization of avermectin crude powder
and its impurities analysis
ABSTRACT Avermectin crude powder were purified by crystallization and its impurities were identified by HPLC (high performance liquid chromatography)ESIMSMS (electrospraymass spectrometrymass spectrometry). Main impurities in crude powder were B1b, A1a, A1b, A2a, A2b and B2a, which were similar to B1a in structure. The separation of A1a, B1b and B2a was very difficult due to their greatly similar structures to B1a. Recrystallizaton using methanol, ethanol, nbutanol and acetone as solvents were done respectively and it was found that methanol and nbutanol were good solvents for the separation of impurities. The impurities could be selectively separated using methanol or acetone.
　KEY WORDS Avermectin; HPLC; Mass spectrometry; Impurities; Crystallization
Avermectin是十六元大环内酯类抗生素，具有很强的杀虫活性，是一种良好的杀螨虫、昆虫和寄生虫的药物，可以用于人、畜和农作物。将avermectin粗粉重结晶三次，比较各次结晶的纯度及杂质的去除状况。乙醇为结晶溶剂，按照程序降温方法冷却结晶［9］；结晶过程中搅拌速度：150r/min，降温区间为65℃～21℃，晶体纯度采用HPLC分析，由面积归一化法定量。
　Avermectin结晶中的杂质分析 Avermectin粗粉重结晶一次，取结晶母液采用HPLCESIMSMS分析成分。HPLCESIMSMS仪器 配备二元泵，二极管阵列检测器(diode array detector)的高效液相色谱仪(agilent 1100，agilent technology，USA)，色谱柱为C18不锈钢柱(46mm×250mm，5μm)，LCQ Deca XP离子阱质谱仪(thermo finnigan，USA)。HPLC条件 流动相为甲醇∶水(85∶15)，流速1ml/min，进样量10μl，检测波长245nm，柱温35℃。ESIMSMS条件 离子源喷射电压35kV，毛细管温度275℃，夹套气(N2)，流速35Arbitary Units，检测方式为正离子检测。
　结晶溶剂对杂质的去除效果 以甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮作结晶溶剂按程序降温［9］的方式进行冷却结晶，考察不同结晶溶剂对杂质的去除效果。结晶过程中搅拌速度150r/min，降温区间：甲醇结晶55℃～21℃，丙酮结晶50℃～21℃，正丁醇结晶：65℃～21℃。晶体纯度采用HPLC分析，由面积归一化法定量。
2 结果与讨论
　Avermectin粗粉的重结晶以乙醇作为结晶溶剂对avermectin粗粉进行重结晶，HPLC分析给出粗粉、一次重结晶、二次重结晶和三次重结晶所得晶体中B1a的纯度分别为7865%、9356%、9543%和9597%，各次重结晶所得晶体的HPLC分析结果如表1所示。B1a组分的保留时间为17736min，由标准品的HPLC对照得到。结晶对某些保留时间组分的去除效果较好，例如对保留时间在12496和21716min组分，一次重结晶基本可以去尽；另一些组分(保留时间在9409、14212和24337min的组分)则通过多次重结晶亦难去除，导致多次重结晶都难以得到纯度较高的avermectin产品。深入研究avermectin的结晶，需对avermectin粗粉中的其他成分进行分析。

　Avermectin结晶中的杂质分析对avermectin粗粉重结晶所得的结晶母液进行 表1 Avermectin重结晶各组分HPLC分析从液相色谱共分离出10个谱峰，DAD检测发现7个含量较高的组分在245nm处都有紫外最大吸收，紫外吸收峰形相似如图2所示，推测其主体大环内酯结构相同，均是avermectin类物质。对含量较高的7个谱峰进行ESIMSMS分析得到各组分的分子离子峰和主要的碎片离子峰(表2)。各组分的分子量是通过加合离子［M+Na］+的质量数来确定的，由分子量可以确定保留时间在12496、14212和24337min的峰为A2a、B1b、A1a组分；保留时间在9409和10384min的峰可能为A2b或B2a；保留时间在17736和21716min的可能为A1b或B1a。这两组组分的区别不能单纯通过分子量来确定，可以结合组分的极性分析来解决：A、B组分的差别在于R1位置分别是H和CH3， 所以A组分 图2 Avermectin粗粉中B1a和主要杂质的紫外光谱图的极性小于B组分。反相色谱分析时，极性越大的保留时间越小，所以，保留时间B文献［10］报道的保留时间大小顺序一致。二级质谱碎片进一步证实前面的分析。二级质谱中高质量端的碎片离子主要来源于［MH2OCO2+H+NA］+、［MH2OCO2+NA］+、［MC7H12O3+H+NA］+、［MC7H12O3+NA］+、［MC14H24O6+NA］+。例如，B1A的ESIMS和ESIMSMS谱图中，M 83453、83339
　　、75140和60735分别来源于［MH2OCO2+H+Na］+、［MH2OCO2+Na］+、［MC7H12O3+Na］+、［MC14H24O6+Na］+；特别是m 75140丰度很高，提示avermectin第一糖基极易断开；m z 60735丰度也比较高，第二糖基也较容易断开。综上所述，avermectin结晶过程中难以去除的杂质实际上是发酵过程中伴随着B1a生成的一组与B1a结构非常类似的物质。Avermectin一次粗粉中杂质含量较高的是A1a、B2a、A2a，B1b其余的几个杂质组分的含量相对较低，经过一次重结晶之后，A2a极易除去，B2a、A1a的去除率也相对较高，但随着重结晶次数的增加，晶体的纯度提高不再明显，某些杂质成分如A1a、B1b、B2a的含量在一次重结晶之后就基本上不再降低，B1a的纯度提高很小。利用结晶很难再将少量的这些杂质去尽，说明普通的冷却结晶方法难以得到更高纯度的avermectin(B1a)结晶。 表2 Avermectin结晶中杂质成分分析 保留时间结晶是根据物质结构和性质特别是溶解性的差异实现分离提纯的。理论上控制冷却结晶过程在一定的温度范围(溶质过饱和结晶析出，杂质不饱和保留在溶液中)可以完全去除杂质，但因实际操作过程(搅拌、结晶器、过饱和度控制等)存在缺陷，往往导致晶体聚结严重，包裹了少量杂质。对以这种机理进入晶体的杂质，可以通过改善结晶操作条件实现更好的分离，例如改善结晶体系的均匀性，更精确的将过饱和度控制在亚稳区以内等。某些结构和性质与溶质非常接近的杂质无法通过结晶条件的改善予以去除。重结晶研究发现，某些含量很低的杂质难以通过结晶进一步分离。一般来说由于结晶的专一性，生长中的晶体对外来杂质具有排斥作用，但有时晶体表面也可以键合一定的杂质质点，特别是它与组成质点晶体构造中较为相似的，比较容易均匀进入晶体，相似性越大进入晶体越容易。杂质进入晶体的方式主要有两种：(1)进入晶格；(2)选择性吸附在一定的晶面上，改变晶面对介质的表面能［11］。大多杂质都吸附在晶面上［12］。杂质的结构与目的产品结构相近对台阶、扭折位置的吸附有效；如两者不同，吸附仅局限于棱边上。所以结构类似物更容易成为结晶过程中不易去除的杂质。由于A1a、B1b、B2a的结构与B1a的结构非常类似，所以在结晶的过程中极其容易吸附在一定的晶面上，甚至于进入晶格。将重结晶所得的晶体进行单晶生长，可以得到表面完整、内部均匀的单晶体，经HPLC分析，所得单晶的纯度并无提高，说明晶体生长过程中，微量杂质可以均匀进入晶格。减少乃至阻止结晶过程中杂质均匀进入晶体，需从微观尺度上分析结晶过程。结晶过程涉及到溶质分子的去溶剂化和晶体的形成。晶体的形成需要两种能量，一种用于形成表面(固液界面表面能)，另一种用于构筑晶体(晶格能)。由于结晶溶剂影响溶质分子的去溶剂化和固液界面的表面能，不同的结晶溶剂中溶剂与溶剂，溶质与溶剂，杂质与溶剂间的作用力，固液界面张力都有所差异，所以考察结晶溶剂对结晶过程的影响是结晶过程研究的一个重要方面。
　不同结晶溶剂对杂质的去除效果实验考察甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮作结晶溶剂的冷却结晶，不同的溶剂结晶所得晶体中各种成分含量的比较见表3。几种常见溶剂结晶的纯度均在93%～96%之间，对杂质的去除效果稍有差别。甲醇和正丁醇的结晶纯度较高，丙酮和乙醇的结晶效果稍差。甲醇结晶可以去尽A2a、A1b，正丁醇结晶基本可以去尽A2b、A2a、A1b，对另外几种杂质的去除效果也较好。但甲醇的毒性较大且挥发性强，可用于结晶的降温区间小，所以一般在可选择的情况下不选择它作为结晶溶剂，正丁醇的结晶纯度比传统的乙醇结晶纯度有较大幅度的提高，并根据avermectin在正丁醇中的溶解度曲线［13］，在相同的温度区间，正丁醇的一次结晶处理量约是乙醇结晶的两倍，所以正丁醇是一种良好的结晶溶剂，可以有效的进行工业应用。比较乙醇和丙酮结晶对杂质的去除状况。这两种溶剂结晶所得晶体纯度相近，但它们对杂质的去除情况不相同，丙酮对B2a和A2b的去除更好一些；乙醇对A2a、B1b、A1b和A1a的去除效果更好。因此在利用多次结晶才可以得到产品时，可以在不同次数的结晶时使用不同的结晶溶剂，使得在一次结晶时重点除去某些杂质，在重结晶时重点除去另外一些杂质，以便以较少的结晶次数得到纯度较高的晶体，提高结晶效率，节约生产成本。
3 结论
　　利用HPLCESIMSMS的方法定性avermectin粗粉中的杂质与avermectin(B1a)结构类似的6个组分B1b、A1a、A1b、A2a、A2b和B2a，其中B1b、A1a、A2a和B2a的含量较高，A1a、B1b、B2a是多次重结晶也难以去除的杂质。考察了avermectin粗粉在甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮中的重结晶，甲醇和正丁醇对杂质的去除效果更好；乙醇与丙酮结晶效果相当，但对杂质去除的选择性不同，丙酮对B2a和A2b的去除更好一些，而乙醇对A2a、B1b、A1b和A1a的去除效果更好。Avermectin结晶中杂质的分析有利于指导结晶溶剂的选择，例如，可以针对重点需去除的杂质成分使用不 表3 不同结晶溶剂的结晶效果比较 结晶溶剂同溶剂的重结晶方法，以减少总的结晶次数，提高结晶效率。致谢：石家庄华北制药集团爱诺有限公司提供avermectin粗粉和精粉。
参考文献
［1］ Tsukamoto Y, Cole L M, Casida J E. Avermectin chemistry and action: esterand ethertype candidate photoaffinity probes ［J］. Bioorg Med Chem,2000,8:19
［2］ Shoop W L, Mrozik H, Fisher M H. Structure and activity of avermectins and milbemycins in animal health ［J］. Vet Parasitol,1995,59(2):139
［3］ Mckellar Q A, Benchaoui H A. Avermectins and milbermycins ［J］. J Vet Pharmacol Ther,1996,19(5):331
［4］ Shipp J L, Wang K, Ferguson G. Residual toxicity of avermectin B1 and pyridaben to eight commercially produced beneficial arthropod species used for control of greenhouse pests ［J］. Biol Control,2000,17:125
［5］ 李俊锁，邱月明，王超. 兽药残留分析――阿维菌素类药物残留分析［M］. 上海：上海科学技术出版社，2002：501
［6］ 扈洪波，朱蓓蕾，李俊锁. 阿维菌素类药物的研究进展［J］. 畜牧兽医学报，2003，31(6)：520
［7］ Shoop W L, Egerton J R, Eary C H, et al. Eprinomectin: a novol avermectin for use as a topical endectocide for cattle ［J］. Int J Parasitol,1996,26(11):1237
［8］ 田益民，杨红，李艳芳. 阿维菌素结晶工艺的改进［J］. 中国医药工业杂志，2002，33(9)：432
［9］ 谢智，常志东，孙兴华等. Avermectin冷却结晶工艺的研究［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(1)：58
［10］ 沈寅初，杨慧心. 杀虫抗生素Avermectin的开发及特性［J］. 农药译丛，1994，16(3)：1
［11］ 张克从，张乐氵惠. 晶体生长科学技术［M］. 北京：科学出版社，1997：223
［12］ Myerson A S. Crystallization as a separations process ［M］. Washington DC: American Chemical Society,1990:419:85
［13］ 谢智，季清荣，常志东，等. Avermectins在不同溶剂中溶解度测定与关联［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(1)：42