酶法提取响铃草总黄酮的工艺研究.docx
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1、中文摘要目的 通过酶法提取响铃草中总黄酮,进而对其提取工艺进行优选。黄酮是一类化学物质的简称,在心脑血管系统、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和杀虫等方面具有较强的药理活性。方法 采用纤维素酶辅助提取响铃草中总黄酮,通过单因素试验:控制乙醇浓度、料液比、纤维素酶用量、酶解时间、酶解pH、酶解温度来对响铃草总黄酮提取率进行研究。再进行正交试验,确定最佳工艺。结果对响铃草总黄酮提取率的主次影响顺序:酶解pH酶解时间料液比乙醇浓度;确定了酶法提取响铃草总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1:25、酶解pH4.40、酶解时间150min、酶解温度55C,纤维素酶用量8mg/g,在此最佳条件下,响铃
2、草中黄酮提取率为0.64%o结论利用纤维素酶辅助提取响铃草中总黄酮的工艺具有一定的可行性,可以为响铃草的二次开发提供参考依据。关键词:纤维素酶;响铃草;黄酮类化合物;提取工艺;单因素实验和正交实验AbstractObjective by enzyme extraction of total flavonoids from Bell grass, then theextraction process is optimized. Flavonoids are a class of chemicals called,cardio-cerebrovascular system, anti-inflam
3、matory, antibacterial, antiviral, antitumor,antioxidant free radical and insecticidal has strong pharmacological activity. Methodsusing cellulose enzyme-assisted extraction of total flavonoids from Bell grass.through a single factor: controlling alcohol concentration, the amount of solid-liquidratio
4、, cellulase, enzyme, enzyme solution pH, enzymatic hydrolysis temperature tostudy the rate of total flavone extract of bells. Orthogonal test to determine the besttechnology. Results on Bell grass total yellow ketone extraction rate of primary andsecondary effect order: enzyme solutions pH enzyme so
5、lutions time materialliquid than ethanol concentration; determine has enzyme method extraction Bellgrass total yellow ketone of best process conditions for ethanol concentration 60%,and material liquid than 1:25, and enzyme solutions pH4.40, and enzyme solutionstime 150min, and enzyme solutions temp
6、erature 55 C, and cellulose enzyme dosage8mg/g, on this best conditions , yellow ketone extraction rate for 0.64%. Conclusionscellulose enzyme-assisted extraction process of total flavones from Bell grass iscertainly feasible, Hoping can provide the reference for the secondary development ofBell gra
7、ss.Key words: cellulase; Bell grass; flavonoid compounds; extraction technology ;single element and orthogonal experiment酶法提取响铃草总黄酮工艺研究响铃草为豆科植物假地蓝的干燥全草,作为民间中草药,响铃草有着悠久的药用历史,它主要分布在四川、贵州、云南、等地。功能主治:耳聋耳鸣、扁桃体炎、久咳痰血、疗毒恶疮、淋巴腺炎、月经不调等。史载于明代慎南本草,其味苦微酸、性较寒,归肺、肝、肾经。其主要的化学成分为生物碱、黄酮、有机酸、香豆素、昔类和箭醇等。目前,国内外也已经有许多学者
8、对响铃草黄酮提取物进行研究。但是文献检索未发现有对响铃草进行酶法辅助提取的报道。研究的目的旨在为响铃草的开发利用提供参考,为响铃草更好的应用于临床提供理论依据。1材料、仪器与试剂1.1材料响铃草,购于安微省毫州市三义堂药业有限责任公司;纤维素酶(湖州米线生物科技有限公司)芦丁(中国药品生物制品检定所);1.2试剂亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠均为分析纯。1.3仪器AUY220电子分析天平,PHS-3E pH计;XPF型(pl75圆盘粉碎机(天津市华联矿山仪器厂);科瑞电动缩分机(中国镇江市科瑞制样设备有限公司);HH-4恒温水浴锅(江苏金坛宏华仪器厂);RE-52AA旋转
9、蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱(上海秣马恒温设备厂);科瑞快速压紧制粉机(中国镇江市科瑞制样设备有限公司);V-5800型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);2实验方法2.1工艺流程准确称取响铃草粉末1.00g,用一定的料液比的乙醇溶液在酶解pH、酶解温度、纤维素酶用量的条件下酶解一定时间后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤,减压浓缩,用60%乙醇定容于50ml容量瓶中,得到总黄酮提取液。2.2总黄酮含量测定方法2.2.1对照品溶液的制备 准确称取芦丁 0.0950g,用60%乙醇溶解并定
10、容至250mL的容量瓶中,得到浓度为0.38mg/mL的芦丁对照品溶液。2.2.2标准曲线的绘制E 分别精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中,加5%亚硝酸钠l.OmL摇匀,静置6min,再准确加入10%硝酸铝l.OmL摇匀,静置6min,然后准确加入4%氢氧化钠lOmL,用60%乙醇定容充分摇匀,静置15min后,以缺芦丁溶液为空白,于510mm波长下测定吸光度绘制标准曲线(见图1)。以对照品溶液浓度C(mg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,得线性回归方程为:A=7.3308C-0.0044, R2=0.9997。结果表明芦丁在0
11、.0000-0.0912 mg/mL范围内呈良好线性关系。芦丁浓度(mg/mL)图1标准曲线2.2.3响铃草总黄酮的含量测定 从总黄酮提取液中准确吸取10mL定容于25mL容量瓶中,按照“2.2.2”项下操作于510mm波长下测定吸光度A,利用线性回归方程求得浓度c,再按下式计算黄酮的提取率。黄酮的提取率(%) = (cxVxn) /m xlOO%式中:c为黄酮质量浓度,mg/mL; V为25mL; n为稀释倍数,n=5; m为样品的质量,go2.3提取工艺优化2.3.1单因素试验2.3.1.1乙醇浓度对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份,用15mL的40%、50%、6
12、0%、70%乙醇,在酶解pH为4.00、酶解温度45C,纤维素酶用量8.0mg/g,酶解时间60min的条件下酶解后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤,得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮提取液的吸光度,由线性回归方程计算总黄酮的浓度,再求总黄酮的提取率,结果如图2所示。图2乙醇浓度对响铃草总黄酮提取率的影响从图2中可看出,随着乙醇溶液浓度的增加,黄酮的提取率增大,在乙醇溶液浓度在60%时提取率最大,后随乙醇溶液浓度的增大而呈下降趋势。原因可能浓度较高的乙醇溶液使得一些亲脂性杂质大量溶出,这些杂质与黄酮类化合物竞争与提取溶剂体系结合,影响总黄酮的吸光度的测定,也可能是高浓度的乙
13、醇导致酶的活性减弱,从而导致总黄酮提取率下降。2.3.1.2料液比对响铃草总黄酮提取率的影响准确称取1.00g响铃草粉末4份,按料液比1:15、1:20、1:25、1:30加入60%的乙醇溶液,在酶解pH为4.00、酶解温度50C、纤维素酶用量8.0mg/g,酶解时间60min的条件下进行酶解后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤,得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度,由线性回归方程计算总黄酮的浓度,再求总黄酮的提取率,结果如图3所示。图3料液比对响铃草总黄酮提取率的影响从图3中可看出,随着料液比的增大,黄酮的提取率也随之增大,但料液比为1:25后随料液比的增大黄
14、酮提取率降低,但要考虑到黄酮提取率、溶剂用量以及能耗增加,所选择料液比为1:25是较为理想的提取条件。2.3.1.3纤维素酶用量对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份,分别加入25mL的60%乙醇,在酶解pH为4.00、酶解温度45C,酶解时间60min的条件下,分别加入纤维素酶用量4.0mg/g、6.0mg/g, 8.0mg/g,10.0mg/g进行酶解后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤,得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度,由线性回归方程计算总黄酮的浓度,再求总黄酮的提取率,结果如图4所示。图4纤维素酶用量对响铃草总黄酮提取率的影响从
15、图4中可看出,纤维素酶用量在4.0mg/g到8.0mg/g之间,黄酮的提取率增大,但当酶用量大于8.0mg/g的时候,黄酮的提取率基本保持不变,说明响铃草中总黄酮基本提取完全。考虑到黄酮提取率及物料消耗增加等,所以纤维素酶用量8mg/g是较为理想的提取条件。2.3.1.4酶解时间对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份,分别加入25mL的60%乙醇,在酶解温度50C、纤维素酶用量8mg/g,酶解pH为4.00的条件下,分别按酶解时间60、90、120、150min进行酶解后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤,得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光
16、度,由线性回归方程计算总黄酮的浓度,再求总黄酮的提取率,结果如图5所示。图5酶解时间对响铃草总黄酮提取率的影响由结果(图5)可知,酶解时间在60min到150min之间,提取率升高,但当酶解的时间为120min时黄酮提取率随酶解时间的升高,提取率变化不大,说明响铃草中总黄酮基本提取完全。考虑到黄酮提取率、物料消耗增加以及经济效益等,所以选择酶解时间90150min为正交优化的范围。2.3.1.5酶解PH对响铃草总黄酮提取率的影响准确称取1.00g响铃草粉末4份,分别加入25mL的60%乙醇,在酶解温度50C、纤维素酶用量8.0mg/g、酶解时间90min的条件下,分别在酶解pH值为4.00、4
17、.40、4.80、5.20的条件下进行酶解后,在80C条件下灭酶lOmin,过滤,得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度,由线性回归方程计算总黄酮的浓度,再求总黄酮的提取率,结果如图6所示。图6酶解pH对响铃草总黄酮提取率的影响由图6可知,随着酶解pH值的升高,提取率升高,当酶解PH值达到4.40时提取率最高,随后酶解pH值的升高,提取率反而降低。原因可能是PH影响酶的活性,从而使总黄酮的溶出减少,降低了黄酮的提取率。2.3.1.6酶解温度对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份,分别加入25mL的60%乙醇,在酶解pH为4.40、纤维素酶用量8.0m
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