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1.-血浆蛋白质与含氮化合物的生物化学检验.ppt
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1、总课时:总课时:6 64 4龚晓华龚晓华 5285281364533260913645332609QQ:QQ:836900873836900873血浆蛋白质与含氮化合物血浆蛋白质与含氮化合物的生物化学检验的生物化学检验2临床检验教研室临床检验教研室龚晓华龚晓华n本章内容概要:本章内容概要:第二节第二节 氨基酸代谢紊乱的生物化学检验氨基酸代谢紊乱的生物化学检验第一节第一节 血浆蛋白质的生物化学检验血浆蛋白质的生物化学检验3第三节第三节 嘌呤核苷酸代谢紊乱的生物化学检验嘌呤核苷酸代谢紊乱的生物化学检验1 1、掌握掌握急性时相反应蛋白的概念及临床意义;重要血浆急性时相反应蛋白的概念及临床意义;重要血
2、浆蛋白质的测定方法、参考值和临床意义;嘌呤核苷酸代谢蛋白质的测定方法、参考值和临床意义;嘌呤核苷酸代谢紊乱紊乱高尿酸血症及痛风高尿酸血症及痛风2 2、熟悉熟悉血清蛋白电泳图谱与异常带型、血浆蛋白质的理化血清蛋白电泳图谱与异常带型、血浆蛋白质的理化性质和功能性质和功能 3 3、了解了解氨基酸代谢紊乱、血清特定蛋白质的检测方法氨基酸代谢紊乱、血清特定蛋白质的检测方法n本章教学要求:本章教学要求:4第一节第一节 血浆蛋白质的生物化学检验血浆蛋白质的生物化学检验p机体蛋白质机体蛋白质:p体液蛋白质的检测:体液蛋白质的检测:机体主要的机体主要的 生物大分子生物大分子含量:人体固体成分的含量:人体固体成分
3、的45%种类:种类:10万,万,30005000种种/单细胞单细胞功能:生长,代谢、血凝、运动、免功能:生长,代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等疫、信息传递等疾病发生疾病发生体液蛋白质体液蛋白质异常异常5要判断异常要判断异常首先要清楚正常的血浆蛋白质组成,功能,分类及特点首先要清楚正常的血浆蛋白质组成,功能,分类及特点一、血浆蛋白质的组成、功能及分类一、血浆蛋白质的组成、功能及分类n组成组成:种类:种类:1000种种 已研究已研究500种种 已分已分离离200种种含量:含量:g mg g来源:来源:肝脏肝脏是蛋白质主要的加工厂是蛋白质主要的加工厂6n功能:功能:营养作用,修补组织蛋白营养作用,
4、修补组织蛋白营养作用,修补组织蛋白营养作用,修补组织蛋白;维持血浆胶体渗透压维持血浆胶体渗透压维持血浆胶体渗透压维持血浆胶体渗透压作为作为作为作为PHPHPHPH缓冲系统的一部分缓冲系统的一部分缓冲系统的一部分缓冲系统的一部分作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体;作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体;作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体;作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体;体液免疫防御系统体液免疫防御系统体液免疫防御系统体液免疫防御系统催化作用催化作用催化作用催化作用代谢调控作用代谢调控作用代谢调控作用代谢调控作用参与凝血与纤维
5、蛋白溶参与凝血与纤维蛋白溶参与凝血与纤维蛋白溶参与凝血与纤维蛋白溶解解7n分类分类:依据依据来源来源、分离方法分离方法和和生理功能生理功能来源来源肝生成:肝生成:绝大多数血浆蛋白质绝大多数血浆蛋白质其他组织细胞生成:其他组织细胞生成:免疫球蛋白免疫球蛋白和和蛋白类激素蛋白类激素8分离方法分离方法盐析法:白蛋白盐析法:白蛋白/球蛋白球蛋白(pH7.0半饱和的硫酸铵溶液)半饱和的硫酸铵溶液)电泳法:电泳法:醋酸纤维素薄膜电泳:醋酸纤维素薄膜电泳:6种种琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳:1313种种聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶电泳:30种种SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳:聚丙烯酰胺凝胶等电双向
6、电泳:300种种分分辨辨率率增增高高-+醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜910功能分类功能分类:11二、重要的血浆蛋白质和血清蛋白质电泳二、重要的血浆蛋白质和血清蛋白质电泳正常血清蛋白电泳图谱示意图及其扫描曲线正常血清蛋白电泳图谱示意图及其扫描曲线 12电泳区带电泳区带蛋白质种类蛋白质种类成人参考值成人参考值(g/L)半寿期半寿期(d)分子量分子量(kD)等电等电点点含糖量含糖量(%)功能功能前清蛋白前清蛋白前清蛋白前清蛋白0.20.41.9554.70.5营养、运载营养、运载清蛋白清蛋白 3552151966.245.80维持胶压、运载和维持胶压、运载和营养等营养等1-球蛋白球蛋白1-抗胰蛋白酶
7、抗胰蛋白酶0.92.04524.812蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂1-酸性糖蛋白酸性糖蛋白0.51.25402.7445免疫应答修饰剂免疫应答修饰剂甲胎蛋白甲胎蛋白310569胎儿期蛋白胎儿期蛋白高密度脂蛋白高密度脂蛋白1.73.25200胆固醇逆转运胆固醇逆转运2-球蛋白球蛋白结合珠蛋白结合珠蛋白0.32.02854004.112结合血红蛋白结合血红蛋白2-巨球蛋白巨球蛋白1.33.057205.48蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂铜蓝蛋白铜蓝蛋白0.10.44.51324.4铁氧化酶铁氧化酶-球蛋白球蛋白转铁蛋白转铁蛋白2.03.6779.65.76运铁到胞内运铁到胞内低密度脂蛋白低密度脂蛋白0.61
8、.55300运胆固醇到组织运胆固醇到组织C30.91.81852补体成分补体成分C40.10.42067补体成分补体成分2-微球蛋白微球蛋白0.0010.00211.8纤维蛋白原纤维蛋白原2.04.02.53405.53凝血因子凝血因子-球蛋白球蛋白IgG7.0162414415067.33免疫球蛋白免疫球蛋白IgA0.74.061608免疫球蛋白免疫球蛋白IgM0.42.3597012免疫球蛋白免疫球蛋白C-反应蛋白反应蛋白51156.20炎症介质炎症介质血浆蛋白质的性质功能及其与电泳区带的关系血浆蛋白质的性质功能及其与电泳区带的关系13图谱类型图谱类型TPAlb12低蛋白血症型低蛋白血症型
9、NNN肾病型肾病型NN肝硬化型肝硬化型NNN-(融合)(融合)弥漫性肝损害型弥漫性肝损害型N慢性炎症型慢性炎症型急性时相反应型急性时相反应型NNNM蛋白血症型蛋白血症型在在-区区 带带 中中 出出 现现 M 蛋蛋 白白 区带区带高高2()-球蛋白血球蛋白血症型症型 妊娠型妊娠型N N蛋白质缺陷型蛋白质缺陷型个个 别别 区区 带带 出出 现现 特特 征征 性性 缺缺 乏乏异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征14 A 正常人正常人 B肾病综合征肾病综合征 C 肝硬化肝硬化(-桥桥)D 肝硬化肝硬化(不典型不典型-桥桥)E 多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤IgA型型 F
10、多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤IgG型型典型异常血清蛋白电泳图谱典型异常血清蛋白电泳图谱15正常血清蛋白电泳上显示的宽正常血清蛋白电泳上显示的宽区带主要成区带主要成分分:免疫球蛋白免疫球蛋白(IgIg)。浆细胞病(浆细胞病(plasma cell plasma cell dyscrasiadyscrasia):):异异常浆细胞增殖,产生大量单克隆常浆细胞增殖,产生大量单克隆IgIg或其轻链或其轻链或重链片段,病人血清或尿液中可出现结构或重链片段,病人血清或尿液中可出现结构单一的单一的M M蛋白(蛋白(monoclonal proteinmonoclonal protein)在蛋白电泳时呈现一个色泽深
11、染的窄区带,在蛋白电泳时呈现一个色泽深染的窄区带,此区带较多出现在此区带较多出现在或或区,偶见于区,偶见于区。区。浆细胞病与浆细胞病与M蛋白蛋白 16三、急性时相反应蛋白三、急性时相反应蛋白 急性的全身或系统性炎症包括感染、组织损伤急性的全身或系统性炎症包括感染、组织损伤(如创伤、手术、心肌梗死、恶性肿瘤等)、炎(如创伤、手术、心肌梗死、恶性肿瘤等)、炎症性疾病(如自身免疫性炎症)等情况下,肝脏症性疾病(如自身免疫性炎症)等情况下,肝脏对多种血浆蛋白质合成量发生变化,可有明显的对多种血浆蛋白质合成量发生变化,可有明显的升高或降低,这些变化的血浆蛋白质统称为升高或降低,这些变化的血浆蛋白质统称为
12、急性急性时相反应蛋白(时相反应蛋白(APRsAPRs),增加的蛋白质称为正向,增加的蛋白质称为正向APRsAPRs,下降的蛋白质称为负向,下降的蛋白质称为负向APRsAPRs。17正向正向APRs CRP PCT SAA AAG AAT Hp C4 Fg(FIB)C3 Cp PAAlbTRF负向负向APRsn急性时相反应机制:急性时相反应机制:当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。n急性时相反应的应用:急性时相反应的应用:急性时相反应时急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时
13、血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关,可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理间进程有关,可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。状态。1819四、血浆中几种主要蛋白质四、血浆中几种主要蛋白质(一)血清总蛋白(一)血清总蛋白(TPTP)血清总蛋白是血浆中所有蛋白质含量的总体反映,与血清总蛋白是血浆中所有蛋白质含量的总体反映,与肝脏合成蛋白质功能及免疫球蛋白合成情况有关,尤其肝脏合成蛋白质功能及免疫球蛋白合成情况有关,尤其是结合血清白蛋白浓度,能大概反映免疫球蛋白的含量。是结合血清白蛋白浓度,能大概反映免疫球蛋白的含量。参考值参考值成人:成人:6585g L 201.1.凯氏定氮法参考方法凯氏定氮法参考方
14、法2.2.双缩脲法双缩脲法(最好最好)3.3.酚试剂法酚试剂法4.4.散射比浊法散射比浊法5.5.染料结合法染料结合法6.UV 6.UV 法法n测定方法测定方法1.凯氏定氮法参考标准方法凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro)消化消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵;(耗时)用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵;(耗时)蒸馏蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发;用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发;吸收吸收用酸性溶液(硼酸)吸收气态氨(使用酸性溶液(硼酸)吸收气态氨(使HH+)滴定滴定用已标定的无机酸滴用已标定的无机酸滴(使(使H+恢复),恢复),计算总氮量计算总氮量定蛋白定蛋白(总氮量总氮量
15、-非蛋白氮)非蛋白氮)6.25=6.25=蛋白含量蛋白含量纳氏试剂:碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物,其色度与氨氮含纳氏试剂:碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物,其色度与氨氮含 量成正比。量成正比。n原理:原理:21n评价:评价:优点:准确度高,精密度优点:准确度高,精密度高,灵敏度高,是公认的参高,灵敏度高,是公认的参考方法。考方法。缺点:操作复杂,费时,缺点:操作复杂,费时,不适合常规检测,血清各蛋不适合常规检测,血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是白含氮量会有所变化尤其是疾病时。疾病时。n应用:应用:标准蛋白的标定标准蛋白的标定及校正其它常规方法及校
16、正其它常规方法222.双缩脲法双缩脲法n原理:原理:蛋白质中的肽键蛋白质中的肽键(-CONH-CONH-)在在碱性碱性溶液中能与溶液中能与Cu2+作用而产生作用而产生紫红色络合物紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件:至少含两个肽键(条件:至少含两个肽键(-CONH-CONH-)基团才能和)基团才能和CuCu2+2+形成络合物形成络合物,氨基酸及二肽无反氨基酸及二肽无反 应应,三肽以上才能反应。三肽以上才能反应。双缩脲生成 加热加热NH322H180022222N 端端C 端
17、端23n评价:评价:优点:简便,准确,重复性好,优点:简便,准确,重复性好,10g-120g/L10g-120g/L线性好,线性好,特异性与精密度好,批内特异性与精密度好,批内CV%CV%2%2%,显色稳定。,显色稳定。缺点:灵敏度较差,对蛋白质含量低的体液标本不适缺点:灵敏度较差,对蛋白质含量低的体液标本不适合。合。n应用:应用:常规推荐方法。手工或上机使用。常规推荐方法。手工或上机使用。243.3.酚试剂法酚试剂法n原理:原理:蛋白质分子中的蛋白质分子中的酪氨酸残基酪氨酸残基和和色氨酸残基色氨酸残基能够和能够和酚试剂酚试剂中的中的磷钨酸磷钨酸-磷钼酸磷钼酸反应生成蓝色化合物,反应生成蓝色化
18、合物,LowryLowry改良法:改良法:在酚试剂中加入在酚试剂中加入CuCu2+2+(75%75%呈色),呈色),提高了呈色的灵敏度,为提高了呈色的灵敏度,为双缩脲法的双缩脲法的100100倍左右。倍左右。25n评价及应用:评价及应用:优点:操作简单,改良法灵敏度高(优点:操作简单,改良法灵敏度高(10g-10g-6060g),适合测定蛋白含量少的标本。,适合测定蛋白含量少的标本。缺点:各种蛋白质缺点:各种蛋白质酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸比例不同,只比例不同,只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。264.4.比浊法比浊法n原理:原理:n评价及应用:评价及
19、应用:优点:简便不需特殊仪器。优点:简便不需特殊仪器。缺点:浊度形成的干扰因素多(加试剂方法,反应缺点:浊度形成的干扰因素多(加试剂方法,反应温度,蛋白絮状沉淀等)温度,蛋白絮状沉淀等)某些酸类(磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合某些酸类(磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合产生沉淀,测其浊度,与标准对比,可求蛋白含量。产生沉淀,测其浊度,与标准对比,可求蛋白含量。275.5.染料结合法染料结合法 在酸性环境下,带正电的蛋白质(在酸性环境下,带正电的蛋白质(-NH3+)与染料的阴离子与染料的阴离子产生颜色反应,使染料的吸收峰改变,可既而用分光光度法比产生颜色反应,使染料的吸收峰改变,可既而用分光光度法比
20、色测定。色测定。n原理:原理:常用染料:常用染料:氨基黑,考马斯亮蓝等氨基黑,考马斯亮蓝等n评价及应用:评价及应用:优点:操作简便,重复性好,灵敏度高,且干扰因素少。优点:操作简便,重复性好,灵敏度高,且干扰因素少。缺点:特异性不高;不同蛋白质和染料的结合力不一致,缺点:特异性不高;不同蛋白质和染料的结合力不一致,标准物不易确定。标准物不易确定。286.6.紫外分光光度法紫外分光光度法 蛋白质分子中的蛋白质分子中的酪氨酸酪氨酸和和色氨酸等芳香族氨基酸色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在可使蛋白质溶液在280nm280nm处有一吸收峰处有一吸收峰。可用于测定可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。蛋白
21、质但需避免核酸干扰。(1 1)Lowry-Kalcker Lowry-Kalcker 公式公式 蛋白质浓度(蛋白质浓度(mg/mlmg/ml)=1.45 A=1.45 A 280280-0.74 A -0.74 A 260260 (2 2)Warburg-Christian Warburg-Christian 公式公式 蛋白质浓度(蛋白质浓度(mg/mlmg/ml)=1.55 A=1.55 A 280280-0.76 A -0.76 A 260260 n原理:原理:29n评价及应用:评价及应用:优点:敏感而简便,可优点:敏感而简便,可保留蛋白生物活性保留蛋白生物活性,常用与较纯的酶,常用与较纯
22、的酶和免疫球蛋白。需和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。紫外分光光度计及石英比色皿。缺点:各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同;在缺点:各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同;在280nm280nm测定易受游离色测定易受游离色aaaa和酪和酪aaaa以及尿酸和胆红素的干扰;导以及尿酸和胆红素的干扰;导致准确性和特异性受影响。致准确性和特异性受影响。措施:在措施:在220-225nm220-225nm波长区域,用波长区域,用0.15mol/l0.15mol/l的的NaClNaCl稀释稀释1000-20001000-2000倍可消除干扰。倍可消除干扰。30n结构结构:也称:也称白蛋白白蛋
23、白,585585个个aaaa残基构成的单链多肽,残基构成的单链多肽,MW=66458MW=66458,含,含17个个二硫键。二硫键。n理化性质理化性质:pI=4pI=45.85.8,肝细胞合成但不储存,半衰期,肝细胞合成但不储存,半衰期为为15-19 15-19 天,占总蛋白的天,占总蛋白的40%40%60%60%,p p7.47.4时带负电。时带负电。n测定方法测定方法:色素结合法:色素结合法:溴甲酚绿(溴甲酚绿(BCGBCG),溴甲酚紫),溴甲酚紫(BCPBCP),盐析等。盐析等。(二)清蛋白(二)清蛋白(ALBALB)急性时相反应蛋白急性时相反应蛋白 31参考值参考值成人:成人:4055
24、g L p临床意义:临床意义:白蛋白升高:白蛋白升高:白蛋白降低:白蛋白降低:肝功能下降:慢性肝病肝功能下降:慢性肝病白蛋白丢失:由尿中、胃肠道、皮肤丢失白蛋白丢失:由尿中、胃肠道、皮肤丢失白蛋白分解代谢增加:组织损伤及组织分解增加白蛋白分解代谢增加:组织损伤及组织分解增加白蛋白分布异常:肝硬化等白蛋白分布异常:肝硬化等先天性先天性ALBALB缺乏病:极少见的遗传性疾病缺乏病:极少见的遗传性疾病蛋白质营养不良或吸收不良的评价指标蛋白质营养不良或吸收不良的评价指标真性升高:未见真性升高:未见假性升高:机体明显失水,假性升高:机体明显失水,或治疗输入过多白蛋白或治疗输入过多白蛋白323335g/L
25、 35g/L 正常正常282834g/L 34g/L 轻度缺乏轻度缺乏212127g/L 27g/L 中度缺乏中度缺乏21g/L 21g/L 严重缺乏严重缺乏低于低于28g/L28g/L时会出现组织水肿时会出现组织水肿血浆血浆AlbAlb作为营养指标的评价标准作为营养指标的评价标准p方法方法:间接法间接法:TP-ALB=GLBTP-ALB=GLB直接法直接法:乙醛酸比色法乙醛酸比色法(GLB(GLB中的色氨酸远大于中的色氨酸远大于ALBALB中中的色氨酸含量的色氨酸含量)色氨酸色氨酸+乙醛酸乙醛酸 紫色化合物紫色化合物H H+Hopkins-ColeHopkins-Cole反应反应:成人成人2
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