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优选中药淫羊藿总黄酮含量测定方法【摘要】 目的比较不同测定方法对中药淫羊藿总黄酮含量测定的影响。方法分别采用中国药典(2005版)方法(药典法)和保健食品检验与评价技术规范(2003版)中2种方法(检验一法和检验二法)测定。 结果3批淫羊藿药材中，药典法所测总黄酮含量均值为/kg，检验一法所测总黄酮含量均值为/kg，检验二法测得的总黄酮含量均值为/kg。结论采用保健食品检验二法测定淫羊藿总黄酮含量更为简便、合理，可考虑作为淫羊藿中黄酮类物质含量测定的首选方法。【关键词】 淫羊藿/化学 总黄酮/分析 分光光度法 紫外线淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum( Zucc)Maxim.、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense )、或朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干燥地上部分。本草纲目称其有益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力之功效。各种淫羊藿均以淫羊藿苷、淫羊藿次苷及淫羊藿新苷等黄酮类成分为主1。现代药理实验研究表明,淫羊藿总黄酮能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤等功效。关于总黄酮的测定方法报道较多3-4，目前收载入相关国家标准的有3种方法：国家食品药品监督管理局颁布的保健食品检验与评价技术规范实施手册收载的2种方法(简称检验一法 和检验二法);2005版中国药典收录的方法(简称药典法)。但关于此3法的准确性、合理性比较研究尚未见报道。本试验以淫羊藿为研究对象，以其总黄酮含量为评价指标，比较了上述3种方法对其含量测定的影响，为淫羊藿中总黄酮最佳测定方法的优选提供依据。现报道如下。1 材料1 仪器 8453E型紫外可见分光光度计(美国 Agilent);BP211D电子分析天平(德国Sartorius);KQ500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。2 药材与试剂 淫羊藿药材(样品1批号为080602，样品2批号为080626，样品3批号为080731)购自广州致信药业有限公司，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定，其原植物为小檗碱科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)的干燥地上部分;淫羊藿苷对照品(批号：110737200414)、芦丁对照品(批号：100080200306)均购自中国药品生物制品检定所;聚酰胺粉(柱层析用，6080目)由浙江台州市路桥四甲生化塑料厂生产;水为双蒸水，甲醇、乙醇、苯、硝酸铝等试剂均为分析纯。2 方法与结果药典法测定淫羊藿中总黄酮含量淫羊藿苷对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品，精密称定，加甲醇制成/mL的溶液作为储备液，备用。样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)约，精密称取，按文献方法制备供试品溶液，备用。标准曲线的绘制 取项下储备液，置10mL量瓶中，加甲醇分别配制成浓度为、/mL的溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y=(r=，线性范围/mL)。精密度试验 取淫羊藿对照品溶液(/mL)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为，sR为%，表明精密度良好。重复性试验 精密称取同一供试品，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量的均值为/kg，sR为 %，表明该方法的重复性较好。稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min测定其吸收度，结果其吸光度均值为，sR为%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号：080731，含量/kg)，加入淫羊藿苷进行试验，结果其平均回收率为%，sR为%，结果见表1。表1 加样回收率试验(药典法) 总黄酮测定 分别取供试品溶液和对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，计算，结果3批药材中总黄酮含量均值为/kg。结果见表4。检验一法测定淫羊藿中总黄酮含量芦丁对照品溶液的制备 精密称取经105干燥至恒质量的芦丁标准品，加甲醇溶解并定容至100mL，配成/mL的芦丁标准溶液。样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)，加入80mL体积分数70%乙醇溶液，按文献方法制备供试品溶液，备用。标准曲线的绘制 分别精密量取芦丁标准溶液0、,相当于芦丁0、75、150、300、450、600g,移入10mL刻度比色管中，加入体积分数30%乙醇液至5mL，各加50g/L的亚硝酸钠溶液,振摇后放置5min,加入100g/L的硝酸铝溶液摇匀后放置6min，加/L氢氧化钠溶液2mL,用体积分数30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，在510nm处测定吸光度，以对照品溶液中芦丁的量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y=+(r=，线性范围)。精密度试验 取对照品溶液(/mL)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为，sR为%，表明精密度良好。重复性试验 精密称取同一供试品，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量均值为/kg，sR为%，表明该方法的重复性较好。稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30min测定其吸收度，结果其吸光度均值为，sR为%，说明供试品溶液在30min内稳定。加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号:080731，含量/kg)，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为%，sR为%，结果见表2。表2 加样回收率试验(检验一法)总黄酮测定 取项下样品溶液3mL，至10mL容量瓶中，按项下方法自各加50g/L亚硝酸钠溶液,起，依法测定吸光度，代入回归方程，计算含量，结果3批药材总黄酮含量均值为/kg。结果见表4。检验二法测定淫羊藿中总黄酮含量芦丁对照品溶液的制备 精密称取经105干燥至恒质量的芦丁标准品，加甲醇溶解并定容至100mL，即得/mL芦丁标准溶液。样品溶液的制备 取药材，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数95%乙醇25mL，按照文献方法制备供试品溶液，备用。标准曲线的绘制 吸取芦丁标准溶液0、于10mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm处比色。以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y= - ;r=。线性范围为/mL。精密度试验 取芦丁对照品溶液(/mL)，连续测定5次，结果其吸光度均值为，sR为%，表明精密度良好。重复性试验 精密称取供试品，平行5份，制备供试品溶液，于波长360nm处测定其吸光值，结果其含量均值为/kg，sR为 %，表明重现性较好。稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min时测定其吸收度，结果其吸光度均值为，sR为%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号:080731，含量/kg)，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为%，sR为%，结果见表3。总黄酮含量测定 分别取3批淫羊藿样品，精密称定，按项下制备供试品溶液，于波长360nm处测定吸收值。代入回归方程，计算试样中总黄酮含量。结果3批样品的平均含量为/kg,结果见表4。表3 加样回收率试验(检验二法)表4 3种方法测定淫羊藿样品中总黄酮含量比较3 讨论测定波长的选择 对药典法测定波长的选择，采用淫羊藿苷的甲醇溶液在波长200800nm之间进行扫描，结果在270nm有最大吸收。同法确定了检验一法测定波长在510nm有最大吸收;检验二法测定波长在360nm有最大吸收，均与文献5-6报道测定波长一致。检验一法和检验二法 样品溶液的制备均采用聚酰胺柱层析纯化总黄酮类化合物，主要因为黄酮类化合物大多具有酚羟基，可被聚酰胺吸附，而与不含酚羟基的成分分离，也能排除叶绿素的干扰。因此，是否加显色剂对其含量测定无显着影响，两法测定结果较接近。测定方法的选择 测定结果显示药典法测得值显着大于检验一法和检验二法测得值。主要因为药典法测定时无需显色，在270nm有吸收的化合物均可被测定,故结果偏大。 检验一法测定须经过NaNO2Al(NO3)3NaOH显色，只有具有邻二酚羟基的黄酮类化合物才能被检测出。但在强碱性条件下进行测定时，许多物质在510nm左右产生吸收，从而可能产生含量偏高的效应。而检验二法用聚酰胺柱层析选择性地富集含有酚羟基的黄酮类化合物，不需经显色直接测定，其结果准确、简便，测定方法也更为合理。因此，可考虑作为淫羊藿中黄酮类物质含量测定的首选方法。【参考文献】 1郭宝林,肖培根.5种淫羊藿的不同部位的黄酮类成分分析J.中国中药杂志,1996,21(9):523. 许碧连,吴铁,王辉.淫羊藿总黄酮药理作用的研究现状J.中国临床药理学与治疗学,2003,8(1):115.赵大洲,徐本明,刘珂.三氯化铝络合分光光度法测定淫羊藿中总黄酮含量J.中草药,2004,35(2):213.夏泉,黄赵刚,刘志荣,等.淫羊藿总黄酮胶囊质量标准的研究J.中国药师，2003,6(3):151.黄雨三.保健食品检验与评价技术规范实施手册S.北京：清华同方出版社,2003:1082,1242.