基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析.pdf
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1、【基金项目】*1苏州市基础研究计划(医学应用基础研究)项目(编号:SKY2023220);苏州市卫生青年骨干人才(编号:Qngg2021028);苏州市生物医药产业创新医工结合协同创新研究项目(编号:SLJ2022022);苏州市科教兴卫青年科技项目(编号:KJXW2022045)【作者简介】*2孙青(1994),女,检验师【通信作者】*3黄帆(1996),女,硕士,检验师【电子邮箱】DOI:10.13493/j.issn.1672-7878.2023.10-0020基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析*1孙 青*2,宋华峰,黄 帆*3苏州市第五人民医院(苏州大
2、学附属传染病医院)检验中心,江苏 苏州 215000【摘要】目的:分析基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因突变位点的检测情况,为耐多药结核的临床诊断提供依据。方法:收集 2020 年2023 年在苏州市第五人民医院就诊的 395 例结核患者的痰液标本,采用基因芯片技术对利福平耐药基因 ropB(511、513、516、526、531、533)和异烟肼耐药基因 KatG(315)、inhA(-15)突变位点进行检测,以罗氏固体培养绝对浓度法作为金标准,分析基因芯片技术对 MTB 耐利福平或异烟肼的准确性。结果:基因芯片技术
3、对利福平耐药诊断的 Kappa 值为 0.80,符合率为92.15%,灵敏度为 87.74%,特异度为 93.77%,阳性预测值为 83.78%,阴性预测值为 95.42%,而对异烟肼耐药诊断的 Kappa 值为 0.87,符合率为 93.42%,灵敏度为 98.82%,特异度为 89.38%,阳性预测值为 87.43%,阴性预测值为99.02%。结论:基因芯片技术可以快速、高效地检测 MTB 耐利福平和耐异烟肼基因突变,与罗氏固体培养绝对浓度法高度一致,可为临床诊疗提供依据。【关键词】结核分枝杆菌;基因芯片技术;利福平;异烟肼;耐药基因【中图分类号】R 52;R 446.7【文献标志码】A【
4、文章编号】1672-7878(2023)10-1108-05Detection Analysis of Gene Mutation Sites of Rifampin-or Isoniazid-resistantMycobacterium Tuberculosis Based on Gene Chip Technology*1SUN Qing*2,SONG Hua-feng,HUANG Fan*3Department of Laboratory Medicine,The Fifth Peoples Hospital of Suzhou(The Affiliated Infectious Dis
5、ease Hospitalof Soochow University),Suzhou Jiangsu 215000,ChinaABSTRACTObjective:Toanalyzethedetectionongenemutationsitesofrifampin-orisoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosis(MTB)with the gene chip technology,so as to provide a basis for the clinical diagnosis of multidrug-resistanttuberculosis.
6、Methods:Sputum specimens from 395 tuberculosis patients treated in the Fifth Peoples Hospital of Suzhoufrom 2020 to 2023 were collected,and the gene chip technology was utilized to detect the mutation sites of rifampinresistance gene ropB(511,513,516,526,531,533)and isoniazid resistance genes KatG(3
7、15)and inhA(-15).By usingthe Roche solid culture absolute concentration method as the gold standard,the accuracy of the gene chip technology onMTB resistance to rifampin or isoniazid was analyzed.Results:The Kappa value of the gene chip technology for thediagnosis of rifampin resistance was 0.80,the
8、 coincidence rate was 92.15%,the sensitivity was 87.74%,the specificitywas 93.77%,the positive predictive value was 83.78%,and the negative predictive value was 95.42%.The Kappa valueof the gene chip technology for the diagnosis of isoniazid resistance was 0.87,the coincidence rate was 93.42%,thesen
9、sitivity was 98.82%,the specificity was 89.38%,the positive predictive value was 87.43%,and the negative predictivevalue was 99.02%.Conclusion:The gene chip technology can detect the gene mutations of MTB resistance to rifampinand isoniazid in a rapid and efficient manner,which is highly consistent
10、with the Roche solid culture absolute concentrationmethod and can provide a basis for the clinical diagnosis and treatment.KEY WORDSMycobacterium tuberculosis;gene chip technology;rifampin;isoniazid;drug resistance genesAnti Infect Pharm,2023,20(10):1108-1112抗 感 染 药 学Anti Infect Pharm 2023 October;2
11、0(10)孙 青,等.基于基因芯片技术对耐利福平或异烟肼结核分枝杆菌基因突变位点的检测分析1108组别野生型单利福平耐药单异烟肼耐药利福平异烟肼耐药合计例数220669100395构成比55.701.5217.4725.32100.00表 1395 例患者样本中 MTB 的耐药情况(n/例,%)结 核 病 是 由 结 核 分 枝 杆 菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的以呼吸道传播为主的严重危害人类健康的全球性疾病1。耐多药结核病仍然是全球公共卫生安全面临的重大挑战,随着耐药结核病的发生率逐渐升高,一线抗结核药物的疗效减弱。据相关研究报道,耐多药结核病患者
12、使用抗结核药物治疗的失败率高达 15%77%2-3。利福平(rifampicin,RFP)和异烟肼(isoniazid,INH)是最早发现且临床常用的 2 种一线抗结核药物,随着对 MTB 耐药分子机制研究的进展,有文献报道 MTB 耐利福平的主要分子机制是编码 RNA 聚合酶 亚单位的 rpoB 基因发生突变4,耐异烟肼的主要分子机制是编码过氧化氢酶-过氧化物酶的 KatG 基因和编码烯酞基还原酶的 inhA基因发生突变5。目前,结核耐药性检测的主要方法是体外药物敏感实验,包括固体药敏法和液体药敏法6,但这 2 种方法均依赖于结核分枝杆菌培养。传统药敏法不仅耗时长,而且成本较高,基因芯片检测
13、技术的出现不仅实现了快速、早期对MTB 耐利福平和耐异烟肼的诊断,还能进一步对利福平 ropB 基因位点和异烟肼 KatG、inhA 基因位点进行分析。本研究通过基因芯片技术快速检测 MTB 的耐利福平和耐异烟肼的相关基因突变位点,并与罗氏固体培养绝对浓度法(金标准)进行比较,评价了基因芯片技术对利福平和异烟肼耐药性的诊断价值,从而为临床提供快速、准确的诊断和治疗依据。1资料与方法1.1一般资料收集 2020 年2023 年在苏州市第五人民医院就诊的 395 例结核患者的痰液标本,其中男276 例,女 119 例,平均年龄为(46.4519.31)岁。1.2方法1.2.1基因芯片法耐药基因检测
14、试剂盒由博奥生物有限公司提供,检测基因主要包括利福平rpoB 基因、异烟肼 KatG 基因和 inhA 基因。用 4%NaOH 预处理痰标本,加核酸提取液后使用 ExtractorTM36 核酸快速提取仪提取核酸,将核酸扩增、变性后加入杂交缓冲液,在 BioMixerTM 芯片杂交仪中进行杂交反应,杂交 2 h 后,用 lideWasherTM8 芯片洗干仪进行洗涤和甩干,最后采用微阵列芯片扫描仪对结果进行判读。1.2.2罗氏固体培养绝对浓度法采用 4%NaOH预处理的痰标本,在无菌条件下加入 0.5 mL MGITOADC 营养添加剂和 0.1 mL MGIT PANTA 抗菌素混合溶液,加
15、入 0.5 mL 处理好的标本,颠倒混匀后放入 BACTEC MGIT960 全自动分枝杆菌培养仪进行孵育培养。对阳性培养标本进行抗酸染色涂片,若抗酸染色涂片阳性则进行药敏试验。对培养获得的 MTB 采用罗氏固体培养绝对浓度法进行药敏试验,利福平浓度包括 0、50、250 g/mL,异烟肼浓度包括 0、1、10 g/mL。培养 28 d 后,若菌落数200,报告为敏感(S);若菌落数200,报告为耐药(R)。1.3观察指标(1)395 例患者样本中 MTB 的耐药情况;(2)基因芯片检测 MTB 耐利福平突变位点结果。1.4统计学方法采用 SPSS 26 统计学软件分析数据。以罗氏固体培养绝对
16、浓度法为金标准,采用 2检验计算基因芯片对利福平、异烟肼耐药诊断的 Kappa 值、符合率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。2结果2.1395 例患者样本中 MTB 的耐药情况选取 395 例结核患者临床样本中的 MTB,其中野生型为 220 例(占 55.70%),耐药型为 175 例(占 44.30%),耐药结核患者中耐多药结核占比最高(占 25.32%)。详见表 1。2.2基因芯片检测 MTB 耐利福平突变位点结果采用基因芯片检测 MTB 耐利福平 ropB 基因突变位点,共检测 395 例样本,其中未检测到利福平 ropB 基因位点突变 282 例(占 71.39%),在突变阳
17、性标本中,MTB 耐利福平以 ropB 531(TCG-TTG)突变(占 19.49%)为主。详见表 2。2.3基因芯片检测 MTB 耐异烟肼突变位点结果利用基因芯片检测结核分枝杆菌耐异烟肼KatG、inhA 基因位点突变,共检测 395 例样本,其中未检测到异烟肼 KatG、inhA 基因位点突变 204 例(204/395,占 51.65%);在突变阳性标本中,MTB 耐ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 October;20(10)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-8780630711
18、09为主,见表 3。2.42 种方法检测利福平和异烟肼药敏结果比较395 例样本基因芯片法和罗氏固体培养绝对浓度法(体外药敏法)试验结果比对显示:基因芯片检测 利 福 平 耐 药 的 Kappa 值 为 0.80、符 合 率 为92.15%、灵敏度为 87.74%、特异度为 93.77%、阳性预测值为 88.29%、阴性预测值为 95.42%;检测异烟肼耐药的 Kappa 值为 0.87、符合率为 93.42%、灵敏度为 98.82%、特异度为 89.38%、阳性预测值为突变情况野生型突变型基因KatGinhAKatGinhA基因位点315-15315-15密码子突变AGC-ACCAGC-AA
19、CC-TAGC-ACCC-T例数2041252604构成比51.6531.650.5015.191.01表 3基因芯片检测 MTB 耐异烟肼 KatG、inhA 基因突变位点结果(n/例,%)表 4基因芯片法和体外药敏法检测利福平和异烟肼的药敏结果比较药物利福平异烟肼基因芯片法耐药敏感合计耐药敏感合计体外药敏法(n/例)耐药93131061672169敏感1827128924202226总计(n/例)111284395191204395Kappa 值0.800.87符合率(%)92.1593.42灵敏度(%)87.7498.82特异度(%)93.7789.38阳性预测值(%)83.7887.4
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