[临床医学]哮喘研究从基础到临床.ppt
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1、 哮喘研究从基础到临床哮喘研究从基础到临床Scientific research on asthma:from bench to bedside浙江大学附属二院呼吸科浙江大学附属二院呼吸科浙江大学呼吸疾病研究所浙江大学呼吸疾病研究所 沈华浩沈华浩哮喘最新定义:哮喘最新定义:支气管哮喘支气管哮喘(简称哮喘简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞、是一种以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和肥大细胞和T T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。这种炎症使易感者产生气道高反应性,慢性炎症。这种炎症使易感者产生气道高反应性,表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳表现为反复发作性的喘息
2、、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状,常在夜间和(或)清晨发作、加剧,嗽等症状,常在夜间和(或)清晨发作、加剧,常伴有广泛多变的可逆性气流受限,多数患者可常伴有广泛多变的可逆性气流受限,多数患者可自行或经治疗后缓解。自行或经治疗后缓解。哮喘研究的动物模型哮喘研究的动物模型 Experimental models for asthma 应用动物模型的价值应用动物模型的价值建立实验动物模型的目的是更好地解释人类建立实验动物模型的目的是更好地解释人类疾病发病过程。通过动物模型,我们可以探疾病发病过程。通过动物模型,我们可以探讨许多难以直接从临床得到的疾病发病机理。讨许多难以直接从临床得到的疾病发病机理。尽管
3、各种动物模型在体现人类疾病上还存在尽管各种动物模型在体现人类疾病上还存在一定的缺陷,但不可否认的是通过动物模型一定的缺陷,但不可否认的是通过动物模型所得到的信息,使得我们对人类疾病过程有所得到的信息,使得我们对人类疾病过程有了更透彻清晰的认识。了更透彻清晰的认识。人类哮喘的特征人类哮喘的特征气道慢性炎症:大量炎性细胞气道慢性炎症:大量炎性细胞 T T 淋巴细胞、肥大细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润等,它们释放出嗜酸粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润等,它们释放出LTsLTs、PGsPGs、PAFPAF等炎性介质,引起微小血管渗漏、支气管等炎性介质,引起微小血管渗漏、
4、支气管黏膜水肿、腺体分泌增加、粘液栓形成等病理改变,黏膜水肿、腺体分泌增加、粘液栓形成等病理改变,气道高反应性(气道高反应性(AHRAHR):):气道对特异和非特异刺激的高反气道对特异和非特异刺激的高反应性,应性,如组织胺,乙酰甲胆碱。如组织胺,乙酰甲胆碱。气道重建气道重建 :上皮脱落、上皮下基底膜胶原沉积、平滑肌:上皮脱落、上皮下基底膜胶原沉积、平滑肌肥大增殖、粘膜水肿、杯状细胞及粘液腺增生分泌亢进,肥大增殖、粘膜水肿、杯状细胞及粘液腺增生分泌亢进,气道周血管扩张,新生血管形成。气道周血管扩张,新生血管形成。临床研究哮喘受限制临床研究哮喘受限制 一、肺组织标本获取不易,具有一定危险性。并一、
5、肺组织标本获取不易,具有一定危险性。并且仅能反映疾病发展中的某一点,不能全程反映且仅能反映疾病发展中的某一点,不能全程反映疾病过程。疾病过程。二、二、BALFBALF的获取更需疾病允许,尤其哮喘发作时的获取更需疾病允许,尤其哮喘发作时难以获取,不易将肺的结构(病理)和功能(病难以获取,不易将肺的结构(病理)和功能(病理生理)结合起来。理生理)结合起来。三、要明确参与三、要明确参与LARLAR过程的抗体类型很不容易,过程的抗体类型很不容易,因为我们不可能将某个特异抗原免疫病人而使其因为我们不可能将某个特异抗原免疫病人而使其产生相应抗体或为其输注抗原特异性抗体。产生相应抗体或为其输注抗原特异性抗体
6、。四、不能冒着哮喘发作的危险来探索引起哮喘发四、不能冒着哮喘发作的危险来探索引起哮喘发作的抗原。作的抗原。研究哮喘的动物研究哮喘的动物1 1 生来具有反复发作性喘息的动物:猫、马。生来具有反复发作性喘息的动物:猫、马。2 2 抗原激发前即具有抗原激发前即具有AHRAHR的动物:狗、啮齿类动物的动物:狗、啮齿类动物 。3 3 仅在抗原激发后方具有可逆性气流阻塞和仅在抗原激发后方具有可逆性气流阻塞和/或或AHRAHR的动物:兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。的动物:兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。生来具有反复发作性喘息的动物生来具有反复发作性喘息的动物 马亦存在自发性反复发作的气流阻塞。这是因为致敏状态的马马亦
7、存在自发性反复发作的气流阻塞。这是因为致敏状态的马经常暴露于含有真菌孢子的干草的缘故。经常暴露于含有真菌孢子的干草的缘故。相同点:相同点:哮喘类型哮喘类型 与人类哮喘相似的特征与人类哮喘相似的特征职业性哮喘职业性哮喘 暴露于抗原时症状明显暴露于抗原时症状明显 脱离抗原环境、症状缓解脱离抗原环境、症状缓解 AHRAHR可因脱离抗原而降低可因脱离抗原而降低变应性哮喘变应性哮喘 可逆性反复发作的气流阻塞可逆性反复发作的气流阻塞 发作后可缓解发作后可缓解 具有明确的过敏原具有明确的过敏原抗原激发诱导可逆性气流阻塞和抗原激发诱导可逆性气流阻塞和气道高反应性的动物气道高反应性的动物 兔兔 羊羊 豚鼠豚鼠
8、大鼠大鼠 小鼠小鼠 激发抗原的选择激发抗原的选择 1.Protein antigen e.g.OVA,Der p,Bet V2.House dust mite(HDM)3.Fungi e.g.Aspergillus fumigatus(extract or connidia)4.Parasites e.g.Schistosoma mansoni5.Worm e.g.Nippostrongylus brasiliensis6.Chemical compounds e.g.toluenediisocyanate激发抗原的选择激发抗原的选择 The allergen source should re
9、flect the human situation:1.HDM,pollen and fungi are natural allergens2.inhalation is the natural exposition route 3.extracts or pollen starch granula are better than purified protein,but,high degree of variance豚鼠曾经广泛应用于哮喘研究,直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR时相,之后许多学者应用豚鼠研究了LAR。BrattardBrattard (19851985)OVA+A
10、l(OH)OVA+Al(OH)2 2致敏豚鼠致敏豚鼠(IP)IP),使动物机体产生使动物机体产生OVAOVA特异性特异性IgEIgE和和IgGIgG.在麻醉状态下,气管内滴注在麻醉状态下,气管内滴注OVAOVA微粒抗原致敏微粒抗原致敏,6 6小时后可诱发出小时后可诱发出LARLAR,4848小时后消失。小时后消失。该模型中,该模型中,IARIAR时相产生的肺阻力大于时相产生的肺阻力大于2424小时后的小时后的LARLAR。对未致敏豚鼠或产生对未致敏豚鼠或产生IgGIgG而非而非IgEIgE的致敏豚鼠的致敏豚鼠进行攻击均不能诱发出进行攻击均不能诱发出LARsLARs,组织学表现:以嗜酸粒细胞浸润
11、为特征的局限性组织学表现:以嗜酸粒细胞浸润为特征的局限性细支气管炎,平滑肌收缩、粘膜下水肿和气道粘细支气管炎,平滑肌收缩、粘膜下水肿和气道粘液形成在激发前液形成在激发前/后应用激素可抑制后应用激素可抑制LARLAR时相反应,时相反应,但并不能阻断炎症细胞的募集。但并不能阻断炎症细胞的募集。建建立立豚豚鼠鼠哮哮喘喘模模型型有有多多种种不不同同的的方方法法(抗抗原原种种类类、致致敏敏方方式式等等)、不不同同的的麻麻醉醉方方法法和和肺肺功功能能测测定定方方法法;结结果果表表示示也也有有不不同同的的方方法法(LARLAR出出现现的的时时间间、LARLAR产产生生的的次次数数、LARLAR强强度度)。这
12、这说说明明即即使使在在同同一一品品系系动动物物,应应用用不不同同的的方方法法可可引引起起不不同同程程度度的的气气流流阻阻塞塞。重重要要的的是是在在不不同同的的背背后后存存在在相相同同之之处处。如如在在三三组组实实验验中中有有两两组组证证明明了了在在引引起起LARsLARs方方面面抗抗原原特特异异性性IgEIgE比比抗抗原原特特异异性性IgGIgG更更为为重重要要。此此外外,所所用用实实验验均均说说明明了了EosEos的的肺肺内内募募集集与与LARLAR存存在在相关性。相关性。1.1.应应用用OVAOVA主主动动免免疫疫致致敏敏或或应应用用大大鼠鼠杂杂交交瘤瘤产产生生的的 抗二硝基酚抗二硝基酚I
13、gEIgE被动免疫致敏。被动免疫致敏。2.2.气管内给予特异性抗原。气管内给予特异性抗原。3.3.2424hrhr后后,OVAOVA致致敏敏组组BALBAL中中多多形形核核细细胞胞明明显显高高于于对对照照组组,被被动动免免疫疫致致敏敏组组(IgEIgE致致敏敏组组)应应用用抗抗原原雾雾化化攻攻击击1 12 2hrhr后后BALBAL中中的的多多形形核核细细胞胞明明显显上上升,升,2424hrhr恢复正常。恢复正常。4.4.对对IgEIgE致致敏敏组组进进行行组组织织病病理理学学检检查查显显示示,攻攻击击2 2h h后后可可见见肺肺泡泡和和间间质质水水肿肿,伴伴有有局局限限性性细细支支气气管管周
14、周围围多多形形核核细细胞胞浸浸润润,炎炎症症在在2424hrhr后后消消失失。另另外外可可见间质内单核见间质内单核/巨噬细胞浸润。巨噬细胞浸润。5.5.无无论论是是主主动动免免疫疫致致敏敏还还是是被被动动免免疫疫致致敏敏大大鼠鼠,均均能建立起抗原特异性能建立起抗原特异性IgEIgE依赖的气道炎症。依赖的气道炎症。小鼠小鼠1.1.小小鼠鼠模模型型已已成成为为研研究究抗抗原原诱诱导导的的气气道道反反应应性性的的一一个个重重要要的的模模型型,因因为为对对小小鼠鼠免免疫疫系系统统认认识识广广泛泛全全面面,可可以以用用来来研研究究T T细细胞胞在在AHRAHR发发生生发展中的作用。发展中的作用。2.2.
15、小小鼠鼠不不仅仅可可用用常常规规方方法法激激发发,也也可可采采用用其其他他更更简简易易的的方方法法。如如观观察察静静脉脉给给予予MCHMCH致致气气道道收缩所需浓度。收缩所需浓度。小鼠小鼠3 3 正常或抗原致敏的小鼠气道可用来研究电正常或抗原致敏的小鼠气道可用来研究电刺激后神经元介质的释放。如对某一品系刺激后神经元介质的释放。如对某一品系的小鼠反复抗原暴露可使气道对神经刺激的小鼠反复抗原暴露可使气道对神经刺激的反应增强,表现为达到的反应增强,表现为达到5050最大收缩最大收缩(ESES5050)所需的电刺激频率明显降低,其原所需的电刺激频率明显降低,其原因是反复抗原刺激后神经元释放因是反复抗原
16、刺激后神经元释放AchAch能力增能力增强。强。小鼠小鼠最初的小动物模型之一采用了最初的小动物模型之一采用了BALB/cBALB/c小鼠小鼠,动物经皮给予动物经皮给予 picrylpicryl chloride chloride 致敏,后滴致敏,后滴鼻给予同一致敏原激发,于激发后鼻给予同一致敏原激发,于激发后2424至至4848小小时可见支气管周围及血管周围巨噬细胞及淋时可见支气管周围及血管周围巨噬细胞及淋巴细胞积聚,同时伴肺阻力增加,但无动态巴细胞积聚,同时伴肺阻力增加,但无动态顺应性改变。顺应性改变。小鼠小鼠A/JA/J小小鼠鼠以以绵绵羊羊血血红红细细胞胞致致敏敏激激发发可可致致AHRAH
17、R及及明明显显的的肺肺EosEos炎炎症症,而而使使用用抗抗CD4CD4单单克克隆隆抗抗体体阻阻断断CD4+TCD4+T细细胞胞后后AHRAHR及及肺肺EosEos炎炎症症均均被被抑抑制制,可可见见该该模模型型中中气气道道功功能能的的改改变变依依赖赖 CD4CD4T T细胞,而细胞,而EosEos是该反应的效应细胞。是该反应的效应细胞。有两种方法证实此模型存在气道功能的改变。有两种方法证实此模型存在气道功能的改变。1 1、采用整体体积描记法:经静脉给予浓度依次增、采用整体体积描记法:经静脉给予浓度依次增高的高的MCHMCH后发现气流传导(后发现气流传导(airway conductanceai
18、rway conductance)改变,致敏组较非致敏组对改变,致敏组较非致敏组对MCHMCH的反应性明显增高。的反应性明显增高。2 2、采用体外测定法:离体气道平滑肌给予一定量、采用体外测定法:离体气道平滑肌给予一定量的电流刺激,随着刺激频率的增加气道收缩增强,的电流刺激,随着刺激频率的增加气道收缩增强,结果致敏组小鼠的结果致敏组小鼠的ESES5050较非致敏小鼠明显降低,其较非致敏小鼠明显降低,其机理可能是电流刺激后致敏小鼠气道副交感神经末机理可能是电流刺激后致敏小鼠气道副交感神经末梢释放梢释放ACHACH较非致敏小鼠多,同时伴较非致敏小鼠多,同时伴M M2 2毒蕈碱受体功毒蕈碱受体功能丧
19、失。能丧失。急性哮喘模型 Protocol Sensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)1st 2nd 1st 2nd 3rd Days 0 14 24 25 26 28 Analysis (Airways Inflammation)(Lung histology)(Th1/Th2 responses)Advantages of an acute allergic mouse model Similar to humans-Airway hyperresponsivenss-Eosinophylia-Increased IgE-Goblet cell hyper
20、plasia/metaplasia-Mucus hypersecretion-Mucosal Edema Advantages of an acute allergic mouse model Useful for basic research:-Role of eosinophils and CD4+T-lymphocytes-Adhesion and chemotactic molecules and cell recruitment -Test conventional pharmacological agents-Transgenic and gene-targeted mouseBA
21、LB/cBALB/c和和 C57BL/6JC57BL/6J(B6B6)小鼠小鼠.近年来随着分子生物学的发展,通过转基因近年来随着分子生物学的发展,通过转基因或基因敲除技术,已培育出数十种新的小鼠品或基因敲除技术,已培育出数十种新的小鼠品系系:IL-5IL-5转基因转基因:IL-5+/+IL-5+/+,如如NJ 1638 NJ 1638 和和 NJ 1720NJ 1720).IL-5 IL-5基因敲除(基因敲除(IL-5-/-IL-5-/-)品系品系.IL-4-/-IL-4-/-品系,品系,IFN-a-/-IFN-a-/-品系,品系,CD4-/-CD4-/-、CD8-/-CD8-/-、T T细胞
22、细胞 -/-/-,EotaxinEotaxin+/+/+、EotaxinEotaxin-/-/-,IL-13-/-IL-13-/-,等。等。特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较气道炎症反应比较 细胞细胞/细胞因子细胞因子 气道上皮气道上皮 气道粘液气道粘液 BAL AHR 缺陷缺陷 病理病理 分泌亢进分泌亢进 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 (Mch)B cells +T cells(a,gdgd)alphabeta+T cells gammadelta+T cells +/-?CD4+cells CD8+cells +NK
23、-T cells ND ND +NDEosinophils +/-+/-野生小鼠野生小鼠 +特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较气道炎症反应比较 细胞细胞/细胞因子细胞因子 气道上皮气道上皮 气道粘液气道粘液 BAL AHR 缺陷缺陷 病理病理 分泌亢进分泌亢进 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 (Mch)(IL-5-/-)+/-+/-IL-4-/-+/-+IL-13-/-+/-+/-IFN-r-/-+野生小鼠野生小鼠 +0 3 6 12 25 50 Methacholine Dose(g/kg)Effects of Huan
24、gqi and DXM on airway responsiveness in OVA-sensitized mice.Airway responsiveness was measured at 48h following last OVA challenge.A The Mean dose response curves to nebulized methacholine(Mch).Airway reactivity(Penh,y-axis)in response to increasing doses of nebulized Mch(x-axis)was assessed by whol
25、e-body plethysmography.Data are expredded as the means SEM(n=8-10).*p 0.05 compared with saline/saline mice.p 0.05 compared with saline-treated OVA challenged mice.Disadvantages of an acute allergic mouse model -No asthma spontaneously -No genetic and environmental factors-Airways insensitive for hi
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