基因工程与食品产业PPT课件.ppt
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1、基因工程与食品产基因工程与食品产业业第一节第一节基因工程概述基因工程概述第二节第二节工具酶与基因载体工具酶与基因载体第三节第三节基因工程的基本技术基因工程的基本技术第四节第四节基因工程在食品产业中的应用基因工程在食品产业中的应用第一节第一节 基因工程概述基因工程概述一、基因工程的概念与主要内容一、基因工程的概念与主要内容二、基因工程的发展概况二、基因工程的发展概况核核酸酸核糖核酸核糖核酸(RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)核糖体核糖体RNA(rRNA)转运转运RNA(tRNA)信使信使RNA(mRNA)分类分类分布分布细胞核、细胞核、线粒体、叶绿线粒体、叶绿体、质粒等体、质粒等功能功能
2、遗传信息的遗传信息的载体载体细胞质细胞质、细、细胞核胞核核糖体的成分核糖体的成分转运氨基酸转运氨基酸传递传递DNA的遗的遗传信息,指导传信息,指导蛋白质合成蛋白质合成u元素组成元素组成:C、H、O、N、P(9%10%)u分子组成分子组成三部三部分分碱基碱基(base):嘌呤碱,嘧啶碱:嘌呤碱,嘧啶碱戊糖戊糖(ribose):核糖,脱氧核糖:核糖,脱氧核糖磷酸磷酸(phosphate)二、核酸的化学组成二、核酸的化学组成n构成核酸的基本单位为核苷酸构成核酸的基本单位为核苷酸核酸中的碱基分两类:核酸中的碱基分两类:(1 1)嘧啶碱:)嘧啶碱:胞嘧啶(胞嘧啶(C C)尿嘧啶(尿嘧啶(U U)胸腺嘧啶
3、(胸腺嘧啶(T T)(2 2)嘌呤碱:)嘌呤碱:腺嘌呤(腺嘌呤(A A)鸟嘌呤(鸟嘌呤(G G)核苷核苷脱氧核苷脱氧核苷碱基碱基种类:种类:核苷核苷1 1O ON NN NN NH H2 21 1O OH HO OCHCH2 2O OH HO OH H核糖核糖核苷酸核苷酸(ribonucleotide)(ribonucleotide)O ON NN NN NH H2 2O OCHCH2 2O OH HO OH HP PO OO OO OH HO OH H核苷核苷/脱氧核苷脱氧核苷磷酸酯键磷酸酯键l核苷酸核苷酸的结构:的结构:磷酸磷酸5端端3端端多个核苷酸多个核苷酸3 3,5,5磷酸二酯键磷酸二
4、酯键核酸核酸A AO OCHCH2 2O OH HP PO OO OO O-O O5C CO OCHCH2 2P PO OO OO O-O O35T TO OCHCH2 2P PO OO OO O-O O35多个核苷酸多个核苷酸复制复制(replication)是指遗传物质的传代,以母链是指遗传物质的传代,以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。亲代亲代DNA复制复制子代子代DNA参与DNA复制的物质DNA复复制系统制系统底物底物dNTP聚合酶聚合酶DNA-pol模板模板解成单链单链解成单链单链的的DNA母链母链引物引物与模板互补的与模板互补的RNA片段片段其它酶其它酶和
5、蛋白质因子和蛋白质因子底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶简写简写为为DNA-pol模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer):提供提供3-OH末端末端使使dNTP可以依可以依次聚合次聚合解螺旋酶解螺旋酶引物酶引物酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白DNA连接酶等连接酶等半保留复制:半保留复制:新新DNADNA分子中的两条分子中的两条链,一条来自亲代链,一条来自亲代DNADNA分子,另一条是分子,另一条是新合成的新合成的转录(transcri
6、ption)u生物体以生物体以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程的过程。u此过程把此过程把DNA的碱基序列转抄成的碱基序列转抄成RNA。一、基因工程的概念与主要内容一、基因工程的概念与主要内容(一)基因工程的概念(一)基因工程的概念n基因工程:基因工程:运用酶学方法,将外源基因与载体运用酶学方法,将外源基因与载体DNADNA在体外进行重组,将形成的重组在体外进行重组,将形成的重组DNADNA转入受转入受体细胞,使外源基因在其中复制表达,从而改体细胞,使外源基因在其中复制表达,从而改造生物特性,生产出人类所需要的产物的高新造生物特性,生产出人类所需要的产物的高新技术。技术。n食品基因工程:食
7、品基因工程:利用基因工程的技术和手段,在分子水平利用基因工程的技术和手段,在分子水平上定向重组遗传物质,以改良食品的品质上定向重组遗传物质,以改良食品的品质和性状,提高食品的营养价值、贮藏加工和性状,提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。性状以及感官性状的技术。(二)二)基因工程的主要内容基因工程的主要内容概括起来,基因工程的操作过程一般分概括起来,基因工程的操作过程一般分4个步骤。个步骤。获得目的基因;获得目的基因;将目的基因与载体连接形成重组将目的基因与载体连接形成重组DNA;将重组将重组DNA导入受体细胞;导入受体细胞;筛选出能表达目的基因的受体细胞筛选出能表达目的基因的受
8、体细胞酶酶段段子子体体二、二、基因工程的发展概况基因工程的发展概况19721972年,年,BergBerg等首次用限制性内切酶等首次用限制性内切酶EcoEcoRIRI切割病毒切割病毒SV40 DNASV40 DNA和和噬菌体噬菌体DNADNA,经经过连接,组成重组过连接,组成重组DNADNA分子。分子。19731973年,年,CohenCohen将伤寒沙门氏菌抗链霉素质将伤寒沙门氏菌抗链霉素质粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组,获粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组,获得异源的重组质粒得异源的重组质粒DNADNA,并把重组质粒导入大并把重组质粒导入大肠杆菌中,建立了抗四环素和抗链霉素的大肠杆菌中
9、,建立了抗四环素和抗链霉素的大肠杆菌克隆体肠杆菌克隆体.PaulBerg(whosharedthe1980NobelPrizeinchemistryforthiswork).1972StanleyCohenandHerbertBoyerdiscoverrecombinantDNAtechnology,consideredtobethebirthofmodernbiotechnologyHerbert W.Boyer,Ph.D.第一例基因工程实验1972年年美国加州大学的美国加州大学的Boyer从大肠杆菌中发现了一种从大肠杆菌中发现了一种能够在特定位置上切割能够在特定位置上切割DNA分子的酶即限
10、制性内切酶分子的酶即限制性内切酶19861986年美国和法国的科学家在世界上第年美国和法国的科学家在世界上第一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。验。经过几十年的发展,基因工程技术已走出经过几十年的发展,基因工程技术已走出实验室,基因工程技术的应用已发展成为一个实验室,基因工程技术的应用已发展成为一个巨大的产业,基因工程在农业、医药、食品、巨大的产业,基因工程在农业、医药、食品、环保等领域已显示出巨大的应用价值。环保等领域已显示出巨大的应用价值。在农业上,基因工程发展速度势头强劲。在农业上,基因工程发展速度势头强劲。据统计,据统计,20002000年全球转
11、基因作物种植面积由年全球转基因作物种植面积由19961996年的年的170170万万hmhm2 2,增加到增加到44204420万万hmhm2 2,增增加了加了2525倍之多。倍之多。20002000年美国、加拿大、阿根廷、中国年美国、加拿大、阿根廷、中国4 4个个国家转基因作物的种植面积占全球种植面积国家转基因作物的种植面积占全球种植面积的的99.999.9。全世界转基因作物按种植面积排序分别为全世界转基因作物按种植面积排序分别为大豆、玉米、棉花、油菜籽。大豆、玉米、棉花、油菜籽。我国的农业基因工程研究于我国的农业基因工程研究于2020世纪世纪8080年代初期开始年代初期开始启动,并于启动,
12、并于2020世纪世纪8080年代中期开始将生物技术列入年代中期开始将生物技术列入国家国家“863“863高科技发展计划。高科技发展计划。我国正在研究的转基因植物种类达我国正在研究的转基因植物种类达4747种以上,涉及种以上,涉及各类基因各类基因103103个以上。个以上。目前我国被批准进行商品化生产的目前我国被批准进行商品化生产的6 6种转基因植物种转基因植物:转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。第二节第二节 酶和基因载体酶和基因载体 基因工程的操作,
13、是依赖于一些重要的酶基因工程的操作,是依赖于一些重要的酶(如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶等等)作为工具来对基因进行切割和拼接等操作,作为工具来对基因进行切割和拼接等操作,这些酶被称为这些酶被称为工具酶工具酶(enzyme of tools)(enzyme of tools)。到目前为止,常用的工具酶有到目前为止,常用的工具酶有300300多种。多种。基因工程载体基因工程载体(carrier):(carrier):在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体进入宿主细胞的运载体.一、基因工程的工具酶
14、一、基因工程的工具酶种类主要有种类主要有:l限制性内切酶限制性内切酶l连接酶连接酶l聚合酶聚合酶l核酸酶核酸酶l碱性磷酸酶碱性磷酸酶l逆转录酶逆转录酶 等等 能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为称为核酸酶核酸酶。核酸酶中倾向于将核酸内部的磷酸二酯核酸酶中倾向于将核酸内部的磷酸二酯键切断的酶,称为键切断的酶,称为内切核酸酶内切核酸酶。内切核酸酶中能够识别内切核酸酶中能够识别DNADNA分子上某些分子上某些特定的碱基序列并且将其切开的那一类酶,特定的碱基序列并且将其切开的那一类酶,称为称为限制性内切酶限制性内切酶 。而核酸酶中从聚核苷酸链一端切割磷酸而核酸酶中从
15、聚核苷酸链一端切割磷酸二酯键的酶称为二酯键的酶称为外切核酸酶外切核酸酶。(一)(一)限制性内切酶限制性内切酶在早期,要进行在早期,要进行DNADNA分子的重组,染色体分子的重组,染色体DNADNA通过带小孔的针头或通过超声波破碎为通过带小孔的针头或通过超声波破碎为0.30.35kb5kb的碎片,这种方法只是随机地切的碎片,这种方法只是随机地切断断DNADNA,无法确切地得到目的基因。无法确切地得到目的基因。自从在细菌中发现了一种能够在特定位置自从在细菌中发现了一种能够在特定位置上切割上切割DNADNA分子的酶以后,分子克隆才真正地分子的酶以后,分子克隆才真正地得以发展。得以发展。限制性内切酶是
16、基因工程中不可缺少的工限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工具酶,有人称之为具酶,有人称之为“基因工程的手术刀基因工程的手术刀”。限制性内切酶切点专一,它作用于限制性内切酶切点专一,它作用于DNADNA分子,分子,产生特异的产生特异的DNADNA片段。片段。1、限制性内切酶的分类、限制性内切酶的分类根据限制性内切酶的结构和功能特性,分为三种根据限制性内切酶的结构和功能特性,分为三种类型。类型。lI型限制性内切酶:型限制性内切酶:是多聚体蛋白质,具有切割是多聚体蛋白质,具有切割DNADNA的功能,作用的功能,作用时需要时需要ATPATP、MgMg2+2+和和SS腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸(SAM)(SA
17、M)的存在。的存在。切割切割DNADNA的方式是:先与双链的方式是:先与双链DNADNA上未加修饰上未加修饰的识别序列相互作用,然后沿着的识别序列相互作用,然后沿着DNADNA分子移动,分子移动,在行进相当于在行进相当于1000100050005000个核苷酸的距离个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链之后在随机位置上切割单链DNADNA。由于这类酶由于这类酶不能专门切割不能专门切割DNADNA的某些特殊位点,所以的某些特殊位点,所以未在未在基因工程操作中大量使用。基因工程操作中大量使用。l型限制性内切酶:型限制性内切酶:是一类分子量较小的单体蛋白,作用时仅需要是一类分子量较小的单体蛋白,作用
18、时仅需要MgMg2+2+存在即可维持活性,它可在特殊位点切割存在即可维持活性,它可在特殊位点切割DNADNA,产生具有黏性末端或其他形式的,产生具有黏性末端或其他形式的DNADNA分子片段分子片段.这类酶被广泛地应用于基因工程这类酶被广泛地应用于基因工程l型限制性内切酶:型限制性内切酶:一些具有独特的识别方式和切割方法的内切一些具有独特的识别方式和切割方法的内切酶,如酶,如MboMbo,它识别,它识别GAAGAGAAGA序列,然后在序列,然后在DNADNA的每一条链上识别序列的一侧开始测量的每一条链上识别序列的一侧开始测量一定距离一定距离(如如8 8或或7 7个核苷酸个核苷酸)以后进行切割,以
19、后进行切割,产生仅有一个碱基突出的产生仅有一个碱基突出的33末端末端(N(N表示任表示任意一个碱基意一个碱基)。5GAAGANNNNNNNN33CTTCTNNNNNNN5lI I型限制性内切酶、型限制性内切酶、型限制性内切酶的切点型限制性内切酶的切点不固定,不能产生可以利用的不固定,不能产生可以利用的DNADNA片段片段l型限制性内切酶具有可以控制和预测的位点型限制性内切酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质,并且产生固定的特异性切割的性质,并且产生固定的DNADNA片段。片段。l基因工程所用的限制性内切酶都是基因工程所用的限制性内切酶都是型限制性型限制性内切酶。内切酶。2 2、型限制性内
20、切酶的命名与作用特点型限制性内切酶的命名与作用特点其命名原则是:其命名原则是:用具有某种限制性内切酶的有机体学名用具有某种限制性内切酶的有机体学名缩写来命名,即:缩写来命名,即:有机体有机体属名的第一个字母属名的第一个字母(大写,斜体大写,斜体)和种名的前两个字母和种名的前两个字母(小写,小写,斜体斜体)构成基本名称;构成基本名称;株系数字通常都省略,株系数字通常都省略,但如果酶是存在于一种特殊的菌株中,在基但如果酶是存在于一种特殊的菌株中,在基本名称后面还应该加上菌株的名称符号;罗本名称后面还应该加上菌株的名称符号;罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的马数字用来表示从同一个细菌中分离出来
21、的不同的限制性内切酶。不同的限制性内切酶。例如,例如,EcoEcoR IR I中的中的EcoEco表示从大肠杆菌表示从大肠杆菌(Escherichia coliEscherichia coli)中分离出来的,中分离出来的,R R代表大肠杆代表大肠杆菌的菌的R R株,株,I I表示从中分离出的第一种限制性内切表示从中分离出的第一种限制性内切酶。酶。从流感嗜血菌从流感嗜血菌(Hacmophilus influcnzacHacmophilus influcnzac)中菌株中菌株d d分分离出来的离出来的3 3种限制酶,分别为种限制酶,分别为HinHindIdI、HinHindd、HinHindd。E
22、coEcoRIRI是最早发现的是最早发现的型限制性内切酶,是从型限制性内切酶,是从大肠杆菌中分离鉴定出来的。大肠杆菌中分离鉴定出来的。EcoEcoRIRI可特异地结合在一段可特异地结合在一段6 6个核苷酸的个核苷酸的DNADNA区区域里,在每一条链的域里,在每一条链的鸟嘌呤和腺嘌呤鸟嘌呤和腺嘌呤之间切断之间切断DNADNA链。链。DNADNA链经链经EcoEcoRIRI对称切割后会产生两个单对称切割后会产生两个单链末端链末端.l 型限制性内切酶是一种位点特异性酶,能型限制性内切酶是一种位点特异性酶,能够识别双链够识别双链DNADNA分子中的特异序列,并在特异分子中的特异序列,并在特异部位上切断
23、部位上切断DNADNA分子。分子。l限制性内切酶的识别位点可以是限制性内切酶的识别位点可以是4 4个、个、5 5个、个、6 6个、个、8 8个甚至更多的碱基对。这些个甚至更多的碱基对。这些DNADNA序列大多序列大多呈呈回文结构回文结构,也就是说,序列被正读和反读是,也就是说,序列被正读和反读是一样的。一样的。l由于由于DNADNA具有双螺旋结构,识别核苷酸序列具有双螺旋结构,识别核苷酸序列只能只能从从 5 5末端向末端向3 3末端读其碱基序列末端读其碱基序列,因,因此,在识别序列的两条此,在识别序列的两条核苷酸链中核苷酸链中碱基排列碱基排列次序是完全相同的,这种结构称次序是完全相同的,这种结
24、构称回文结构。回文结构。限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式限制性内切酶按其切割双链限制性内切酶按其切割双链 DNA DNA方式分为两种方式分为两种:黏性末端和平整末端。黏性末端和平整末端。黏性末端黏性末端:限制性内切酶错位切割限制性内切酶错位切割DNADNA双链而双链而形成互补的单链末端形成互补的单链末端。或双链双链DNA中没有配中没有配对的碱基末端,被称为黏性末端对的碱基末端,被称为黏性末端平齐末端平齐末端:有些限制性内切酶在同一位点平有些限制性内切酶在同一位点平齐切割齐切割DNADNA两条链,而形成两端平整的两条链,而形成两端平整的DNADNA分分子子.ucDNAcDNA是在逆转
25、录酶催化作用下,在体外以是在逆转录酶催化作用下,在体外以mRNAmRNA为模板合成的互补为模板合成的互补DNADNA。从真核生物中分离纯化所有的从真核生物中分离纯化所有的mRNAmRNA,接着以,接着以mRNAmRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNAcDNA,随之将,随之将cDNAcDNA与相与相关载体连接,使每一个关载体连接,使每一个cDNAcDNA分子都与一个载体分子都与一个载体分子连接成重组分子连接成重组DNADNA。然后导入宿主细胞进行。然后导入宿主细胞进行扩增,得到分子克隆的混合体,这样一个混合扩增,得到分子克隆的混合体,这样一个混合体就称为体就称为cDNAcDNA文库。文库
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