基因工程与食品产业PPT课件.ppt

基因工程与食品产基因工程与食品产业业第一节第一节基因工程概述基因工程概述第二节第二节工具酶与基因载体工具酶与基因载体第三节第三节基因工程的基本技术基因工程的基本技术第四节第四节基因工程在食品产业中的应用基因工程在食品产业中的应用第一节第一节 基因工程概述基因工程概述一、基因工程的概念与主要内容一、基因工程的概念与主要内容二、基因工程的发展概况二、基因工程的发展概况核核酸酸核糖核酸核糖核酸（RNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA）核糖体核糖体RNA（rRNA）转运转运RNA（tRNA）信使信使RNA（mRNA）分类分类分布分布细胞核、细胞核、线粒体、叶绿线粒体、叶绿体、质粒等体、质粒等功能功能遗传信息的遗传信息的载体载体细胞质细胞质、细、细胞核胞核核糖体的成分核糖体的成分转运氨基酸转运氨基酸传递传递DNA的遗的遗传信息，指导传信息，指导蛋白质合成蛋白质合成u元素组成元素组成:C、H、O、N、P（9%10%）u分子组成分子组成三部三部分分碱基碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖：核糖，脱氧核糖磷酸磷酸(phosphate)二、核酸的化学组成二、核酸的化学组成n构成核酸的基本单位为核苷酸构成核酸的基本单位为核苷酸核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：（1 1）嘧啶碱：）嘧啶碱：胞嘧啶（胞嘧啶（C C）尿嘧啶（尿嘧啶（U U）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）（2 2）嘌呤碱：）嘌呤碱：腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）核苷核苷脱氧核苷脱氧核苷碱基碱基种类：种类：核苷核苷1 1O ON NN NN NH H2 21 1O OH HO OCHCH2 2O OH HO OH H核糖核糖核苷酸核苷酸(ribonucleotide)(ribonucleotide)O ON NN NN NH H2 2O OCHCH2 2O OH HO OH HP PO OO OO OH HO OH H核苷核苷/脱氧核苷脱氧核苷磷酸酯键磷酸酯键l核苷酸核苷酸的结构：的结构：磷酸磷酸5端端3端端多个核苷酸多个核苷酸3 3,5,5磷酸二酯键磷酸二酯键核酸核酸A AO OCHCH2 2O OH HP PO OO OO O-O O5C CO OCHCH2 2P PO OO OO O-O O35T TO OCHCH2 2P PO OO OO O-O O35多个核苷酸多个核苷酸复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。亲代亲代DNA复制复制子代子代DNA参与DNA复制的物质DNA复复制系统制系统底物底物dNTP聚合酶聚合酶DNA-pol模板模板解成单链单链解成单链单链的的DNA母链母链引物引物与模板互补的与模板互补的RNA片段片段其它酶其它酶和蛋白质因子和蛋白质因子底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶简写简写为为DNA-pol模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer):提供提供3-OH末端末端使使dNTP可以依可以依次聚合次聚合解螺旋酶解螺旋酶引物酶引物酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白DNA连接酶等连接酶等半保留复制：半保留复制：新新DNADNA分子中的两条分子中的两条链，一条来自亲代链，一条来自亲代DNADNA分子，另一条是分子，另一条是新合成的新合成的转录(transcription)u生物体以生物体以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程的过程。u此过程把此过程把DNA的碱基序列转抄成的碱基序列转抄成RNA。一、基因工程的概念与主要内容一、基因工程的概念与主要内容（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念n基因工程：基因工程：运用酶学方法，将外源基因与载体运用酶学方法，将外源基因与载体DNADNA在体外进行重组，将形成的重组在体外进行重组，将形成的重组DNADNA转入受转入受体细胞，使外源基因在其中复制表达，从而改体细胞，使外源基因在其中复制表达，从而改造生物特性，生产出人类所需要的产物的高新造生物特性，生产出人类所需要的产物的高新技术。技术。n食品基因工程：食品基因工程：利用基因工程的技术和手段，在分子水平利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。性状以及感官性状的技术。（二）二）基因工程的主要内容基因工程的主要内容概括起来，基因工程的操作过程一般分概括起来，基因工程的操作过程一般分4个步骤。个步骤。获得目的基因；获得目的基因；将目的基因与载体连接形成重组将目的基因与载体连接形成重组DNA；将重组将重组DNA导入受体细胞；导入受体细胞；筛选出能表达目的基因的受体细胞筛选出能表达目的基因的受体细胞酶酶段段子子体体二、二、基因工程的发展概况基因工程的发展概况19721972年，年，BergBerg等首次用限制性内切酶等首次用限制性内切酶EcoEcoRIRI切割病毒切割病毒SV40 DNASV40 DNA和和噬菌体噬菌体DNADNA，经经过连接，组成重组过连接，组成重组DNADNA分子。分子。19731973年，年，CohenCohen将伤寒沙门氏菌抗链霉素质将伤寒沙门氏菌抗链霉素质粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组，获粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组，获得异源的重组质粒得异源的重组质粒DNADNA，并把重组质粒导入大并把重组质粒导入大肠杆菌中，建立了抗四环素和抗链霉素的大肠杆菌中，建立了抗四环素和抗链霉素的大肠杆菌克隆体肠杆菌克隆体.PaulBerg(whosharedthe1980NobelPrizeinchemistryforthiswork).1972StanleyCohenandHerbertBoyerdiscoverrecombinantDNAtechnology,consideredtobethebirthofmodernbiotechnologyHerbert W.Boyer,Ph.D.第一例基因工程实验1972年年美国加州大学的美国加州大学的Boyer从大肠杆菌中发现了一种从大肠杆菌中发现了一种能够在特定位置上切割能够在特定位置上切割DNA分子的酶即限制性内切酶分子的酶即限制性内切酶19861986年美国和法国的科学家在世界上第年美国和法国的科学家在世界上第一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。验。经过几十年的发展，基因工程技术已走出经过几十年的发展，基因工程技术已走出实验室，基因工程技术的应用已发展成为一个实验室，基因工程技术的应用已发展成为一个巨大的产业，基因工程在农业、医药、食品、巨大的产业，基因工程在农业、医药、食品、环保等领域已显示出巨大的应用价值。环保等领域已显示出巨大的应用价值。在农业上，基因工程发展速度势头强劲。在农业上，基因工程发展速度势头强劲。据统计，据统计，20002000年全球转基因作物种植面积由年全球转基因作物种植面积由19961996年的年的170170万万hmhm2 2，增加到增加到44204420万万hmhm2 2，增增加了加了2525倍之多。倍之多。20002000年美国、加拿大、阿根廷、中国年美国、加拿大、阿根廷、中国4 4个个国家转基因作物的种植面积占全球种植面积国家转基因作物的种植面积占全球种植面积的的99.999.9。全世界转基因作物按种植面积排序分别为全世界转基因作物按种植面积排序分别为大豆、玉米、棉花、油菜籽。大豆、玉米、棉花、油菜籽。我国的农业基因工程研究于我国的农业基因工程研究于2020世纪世纪8080年代初期开始年代初期开始启动，并于启动，并于2020世纪世纪8080年代中期开始将生物技术列入年代中期开始将生物技术列入国家国家“863“863高科技发展计划。高科技发展计划。我国正在研究的转基因植物种类达我国正在研究的转基因植物种类达4747种以上，涉及种以上，涉及各类基因各类基因103103个以上。个以上。目前我国被批准进行商品化生产的目前我国被批准进行商品化生产的6 6种转基因植物种转基因植物：转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。第二节第二节 酶和基因载体酶和基因载体 基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶(如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶等等)作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为这些酶被称为工具酶工具酶(enzyme of tools)(enzyme of tools)。到目前为止，常用的工具酶有到目前为止，常用的工具酶有300300多种。多种。基因工程载体基因工程载体(carrier):(carrier):在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体进入宿主细胞的运载体.一、基因工程的工具酶一、基因工程的工具酶种类主要有种类主要有：l限制性内切酶限制性内切酶l连接酶连接酶l聚合酶聚合酶l核酸酶核酸酶l碱性磷酸酶碱性磷酸酶l逆转录酶逆转录酶 等等 能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为称为核酸酶核酸酶。核酸酶中倾向于将核酸内部的磷酸二酯核酸酶中倾向于将核酸内部的磷酸二酯键切断的酶，称为键切断的酶，称为内切核酸酶内切核酸酶。内切核酸酶中能够识别内切核酸酶中能够识别DNADNA分子上某些分子上某些特定的碱基序列并且将其切开的那一类酶，特定的碱基序列并且将其切开的那一类酶，称为称为限制性内切酶限制性内切酶 。而核酸酶中从聚核苷酸链一端切割磷酸而核酸酶中从聚核苷酸链一端切割磷酸二酯键的酶称为二酯键的酶称为外切核酸酶外切核酸酶。（一）（一）限制性内切酶限制性内切酶在早期，要进行在早期，要进行DNADNA分子的重组，染色体分子的重组，染色体DNADNA通过带小孔的针头或通过超声波破碎为通过带小孔的针头或通过超声波破碎为0.30.35kb5kb的碎片，这种方法只是随机地切的碎片，这种方法只是随机地切断断DNADNA，无法确切地得到目的基因。无法确切地得到目的基因。自从在细菌中发现了一种能够在特定位置自从在细菌中发现了一种能够在特定位置上切割上切割DNADNA分子的酶以后，分子克隆才真正地分子的酶以后，分子克隆才真正地得以发展。得以发展。限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人称之为具酶，有人称之为“基因工程的手术刀基因工程的手术刀”。限制性内切酶切点专一，它作用于限制性内切酶切点专一，它作用于DNADNA分子，分子，产生特异的产生特异的DNADNA片段。片段。1、限制性内切酶的分类、限制性内切酶的分类根据限制性内切酶的结构和功能特性，分为三种根据限制性内切酶的结构和功能特性，分为三种类型。类型。lI型限制性内切酶：型限制性内切酶：是多聚体蛋白质，具有切割是多聚体蛋白质，具有切割DNADNA的功能，作用的功能，作用时需要时需要ATPATP、MgMg2+2+和和SS腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸(SAM)(SAM)的存在。的存在。切割切割DNADNA的方式是：先与双链的方式是：先与双链DNADNA上未加修饰上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着的识别序列相互作用，然后沿着DNADNA分子移动，分子移动，在行进相当于在行进相当于1000100050005000个核苷酸的距离个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链之后在随机位置上切割单链DNADNA。由于这类酶由于这类酶不能专门切割不能专门切割DNADNA的某些特殊位点，所以的某些特殊位点，所以未在未在基因工程操作中大量使用。基因工程操作中大量使用。l型限制性内切酶：型限制性内切酶：是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要MgMg2+2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNADNA，产生具有黏性末端或其他形式的，产生具有黏性末端或其他形式的DNADNA分子片段分子片段.这类酶被广泛地应用于基因工程这类酶被广泛地应用于基因工程l型限制性内切酶：型限制性内切酶：一些具有独特的识别方式和切割方法的内切一些具有独特的识别方式和切割方法的内切酶，如酶，如MboMbo，它识别，它识别GAAGAGAAGA序列，然后在序列，然后在DNADNA的每一条链上识别序列的一侧开始测量的每一条链上识别序列的一侧开始测量一定距离一定距离(如如8 8或或7 7个核苷酸个核苷酸)以后进行切割，以后进行切割，产生仅有一个碱基突出的产生仅有一个碱基突出的33末端末端(N(N表示任表示任意一个碱基意一个碱基)。5GAAGANNNNNNNN33CTTCTNNNNNNN5lI I型限制性内切酶、型限制性内切酶、型限制性内切酶的切点型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可以利用的不固定，不能产生可以利用的DNADNA片段片段l型限制性内切酶具有可以控制和预测的位点型限制性内切酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的特异性切割的性质，并且产生固定的DNADNA片段。片段。l基因工程所用的限制性内切酶都是基因工程所用的限制性内切酶都是型限制性型限制性内切酶。内切酶。2 2、型限制性内切酶的命名与作用特点型限制性内切酶的命名与作用特点其命名原则是：其命名原则是：用具有某种限制性内切酶的有机体学名用具有某种限制性内切酶的有机体学名缩写来命名，即：缩写来命名，即：有机体有机体属名的第一个字母属名的第一个字母(大写，斜体大写，斜体)和种名的前两个字母和种名的前两个字母(小写，小写，斜体斜体)构成基本名称；构成基本名称；株系数字通常都省略，株系数字通常都省略，但如果酶是存在于一种特殊的菌株中，在基但如果酶是存在于一种特殊的菌株中，在基本名称后面还应该加上菌株的名称符号；罗本名称后面还应该加上菌株的名称符号；罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的不同的限制性内切酶。不同的限制性内切酶。例如，例如，EcoEcoR IR I中的中的EcoEco表示从大肠杆菌表示从大肠杆菌(Escherichia coliEscherichia coli)中分离出来的，中分离出来的，R R代表大肠杆代表大肠杆菌的菌的R R株，株，I I表示从中分离出的第一种限制性内切表示从中分离出的第一种限制性内切酶。酶。从流感嗜血菌从流感嗜血菌(Hacmophilus influcnzacHacmophilus influcnzac)中菌株中菌株d d分分离出来的离出来的3 3种限制酶，分别为种限制酶，分别为HinHindIdI、HinHindd、HinHindd。EcoEcoRIRI是最早发现的是最早发现的型限制性内切酶，是从型限制性内切酶，是从大肠杆菌中分离鉴定出来的。大肠杆菌中分离鉴定出来的。EcoEcoRIRI可特异地结合在一段可特异地结合在一段6 6个核苷酸的个核苷酸的DNADNA区区域里，在每一条链的域里，在每一条链的鸟嘌呤和腺嘌呤鸟嘌呤和腺嘌呤之间切断之间切断DNADNA链。链。DNADNA链经链经EcoEcoRIRI对称切割后会产生两个单对称切割后会产生两个单链末端链末端.l 型限制性内切酶是一种位点特异性酶，能型限制性内切酶是一种位点特异性酶，能够识别双链够识别双链DNADNA分子中的特异序列，并在特异分子中的特异序列，并在特异部位上切断部位上切断DNADNA分子。分子。l限制性内切酶的识别位点可以是限制性内切酶的识别位点可以是4 4个、个、5 5个、个、6 6个、个、8 8个甚至更多的碱基对。这些个甚至更多的碱基对。这些DNADNA序列大多序列大多呈呈回文结构回文结构，也就是说，序列被正读和反读是，也就是说，序列被正读和反读是一样的。一样的。l由于由于DNADNA具有双螺旋结构，识别核苷酸序列具有双螺旋结构，识别核苷酸序列只能只能从从 5 5末端向末端向3 3末端读其碱基序列末端读其碱基序列，因，因此，在识别序列的两条此，在识别序列的两条核苷酸链中核苷酸链中碱基排列碱基排列次序是完全相同的，这种结构称次序是完全相同的，这种结构称回文结构。回文结构。限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式限制性内切酶按其切割双链限制性内切酶按其切割双链 DNA DNA方式分为两种方式分为两种：黏性末端和平整末端。黏性末端和平整末端。黏性末端黏性末端:限制性内切酶错位切割限制性内切酶错位切割DNADNA双链而双链而形成互补的单链末端形成互补的单链末端。或双链双链DNA中没有配中没有配对的碱基末端，被称为黏性末端对的碱基末端，被称为黏性末端平齐末端平齐末端:有些限制性内切酶在同一位点平有些限制性内切酶在同一位点平齐切割齐切割DNADNA两条链，而形成两端平整的两条链，而形成两端平整的DNADNA分分子子.ucDNAcDNA是在逆转录酶催化作用下，在体外以是在逆转录酶催化作用下，在体外以mRNAmRNA为模板合成的互补为模板合成的互补DNADNA。从真核生物中分离纯化所有的从真核生物中分离纯化所有的mRNAmRNA，接着以，接着以mRNAmRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNAcDNA，随之将，随之将cDNAcDNA与相与相关载体连接，使每一个关载体连接，使每一个cDNAcDNA分子都与一个载体分子都与一个载体分子连接成重组分子连接成重组DNADNA。然后导入宿主细胞进行。然后导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为体就称为cDNAcDNA文库。文库。cDNAcDNA文库文库:指某种特定细胞及特定状态下的全指某种特定细胞及特定状态下的全部部cDNAcDNA克隆。克隆。2 2、DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶连接酶:能将两段能将两段DNADNA拼接起来的酶拼接起来的酶l该酶催化该酶催化DNADNA相邻的相邻的55磷酸基和磷酸基和33羟基末端之羟基末端之间形成磷酸二酯键间形成磷酸二酯键，将将DNADNA单链缺口封合起来。单链缺口封合起来。l大肠杆菌和动植物细胞中都有大肠杆菌和动植物细胞中都有DNADNA连接酶。连接酶。l基因工程中常用的连接酶主要有：基因工程中常用的连接酶主要有：T T4 4DNADNA连接酶连接酶和大肠杆菌连接酶和大肠杆菌连接酶，而以前者为最常用。，而以前者为最常用。T T4 4DNADNA连接酶的相对分子质量为连接酶的相对分子质量为6800068000的单个的单个多肽链，是多肽链，是T T4 4噬菌体感染大肠杆菌而产生的。噬菌体感染大肠杆菌而产生的。在连接反应中多以在连接反应中多以ATPATP为辅助因子。为辅助因子。3 3、DNADNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase)基因工程中常用的基因工程中常用的DNADNA聚合酶有：聚合酶有：大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I(I(全酶全酶)；大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I I大片段大片段(KlenowKlenow片段片段)；T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶；聚合酶；T T7 7噬菌体聚合酶及经修饰的噬菌体聚合酶及经修饰的T T7 7噬菌体聚合酶噬菌体聚合酶(测序酶测序酶)；在细胞内的在细胞内的DNADNA复制过程中起着重要的作用复制过程中起着重要的作用。它们通常被分为它们通常被分为DNADNA聚合酶聚合酶I I、三类。三类。DNADNA聚合酶聚合酶I I是基因工程中最常用的工具酶。是基因工程中最常用的工具酶。耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶)；末端转移酶末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶，也属末端脱氧核苷酸转移酶，也属DNADNA聚合酶聚合酶)；逆转录酶逆转录酶(依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶)。DNADNA连接酶与聚合酶的区别连接酶与聚合酶的区别DNADNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的的33末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNADNA连接连接酶是在两个酶是在两个DNADNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。DNADNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNADNA链为模板，将单个核苷酸链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNADNA链；而链；而DNADNA连接酶是将连接酶是将DNADNA双链上的两个缺口同时连接起来，双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板不需要模板。（1 1）大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I(I(全酶全酶)DNADNA聚聚合合酶酶I I的的相相对对分分子子质质量量为为109000109000，是一条约是一条约10001000个氨基酸残基的多肽链。个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性：它具有三种活性：5 3 DNA5 3 DNA聚合酶活性；聚合酶活性；3 53 5外切核酸酶活性；外切核酸酶活性；5 3 5 3 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。核酸外切酶活性3 5 外切酶外切酶活性活性能辨认错配的碱基对，能辨认错配的碱基对，并将其水解。并将其水解。5 3 外外切酶活性能切除切酶活性能切除突变的突变的DNA片段。片段。(2(2）大肠杆菌）大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段大片段(Klenow(Klenow片段片段)KlenowKlenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的的DNADNA聚合酶聚合酶I I产生的，也可通过克隆技术而获产生的，也可通过克隆技术而获得。得。它的相对分子质量是它的相对分子质量是7600076000，为一条单多肽，为一条单多肽链。链。具有具有5 35 3聚合酶活性和聚合酶活性和3 53 5外切外切酶活性，而无酶活性，而无5 35 3外切酶活性。外切酶活性。KlenowKlenow片段的主要用途片段的主要用途补平限制性内切酶切割补平限制性内切酶切割DNADNA产生的产生的33凹端；凹端；用用 3232PdNTPPdNTP补平补平33凹端，对凹端，对DNADNA片段进行末端片段进行末端标记；标记；对带对带33突出端突出端DNADNA进行末端标记；进行末端标记；cDNAcDNA克隆中，用于合成克隆中，用于合成cDNAcDNA第二链；第二链；在体外诱变中，用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNADNA；应用双脱氧链末端终止法进行应用双脱氧链末端终止法进行DNADNA测序。测序。（3 3）T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶相对分子质量为相对分子质量为114000114000具有具有5353聚合酶活性及聚合酶活性及3535外切核外切核酸酶活性酸酶活性但其但其3535外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNADNA的作用的作用比对双链比对双链DNADNA的作用更强，而且外切核酸酶活的作用更强，而且外切核酸酶活性比性比KlenowKlenow片段要强片段要强200200倍。倍。l主要用途主要用途补平或标记限制性内切酶切割补平或标记限制性内切酶切割DNADNA后产生的后产生的33凹端；凹端；对带有对带有33突出端的突出端的DNADNA分子进行末端标记；分子进行末端标记；标记用作探针的标记用作探针的DNADNA片段；片段；将双链将双链DNADNA的末端转化成为平端；的末端转化成为平端；使结合于单链使结合于单链DNADNA模板上的诱变寡核苷酸引模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸物得到延伸（4 4）T T7 7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶及其改造的测序酶聚合酶及其改造的测序酶 该酶是所有已知该酶是所有已知DNADNA聚合酶中持续合成能力聚合酶中持续合成能力最强的一个，它所催化合成的最强的一个，它所催化合成的DNADNA的平均长度要的平均长度要比其他比其他DNADNA聚合酶催化合成的聚合酶催化合成的DNADNA平均长度大得平均长度大得多。它的多。它的3535外切核酸酶活性约为外切核酸酶活性约为KlenowKlenow片段的片段的10001000倍，但它没有倍，但它没有5353外切核酸酶外切核酸酶活性。活性。l主要用途：主要用途：用于拷贝长段模板的引物延伸反应；用于拷贝长段模板的引物延伸反应；通过补平或交换通过补平或交换(置换置换)反应进行快速末端标反应进行快速末端标记记。（5 5）耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA)(TaqDNA)相对分子质量为相对分子质量为6500065000是一种耐热的依赖是一种耐热的依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。具有具有5353外切核酸酶活性外切核酸酶活性l主要用途主要用途：nDNADNA测序；测序；n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)对对DNADNA片段进行体外扩增片段进行体外扩增 。（6 6）末端转移酶末端转移酶催化脱氧核苷酸添加到催化脱氧核苷酸添加到DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端上末端上催化作用不要求有模板，但需有催化作用不要求有模板，但需有CoCo2+2+的存在。的存在。末端转移酶可给一些末端转移酶可给一些DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端接上末端接上寡寡dAdA或或dGdG；另一些；另一些DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端接上寡末端接上寡dTdT或或dCdC，混合这些分子，即可使同聚物尾部退火形混合这些分子，即可使同聚物尾部退火形成环状分子。成环状分子。l主要用途主要用途：给载体或给载体或cDNAcDNA加上互补的同聚尾；加上互补的同聚尾；DNADNA片段片段33末端的放射同位素标记。末端的放射同位素标记。4.4.碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶：碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链是催化从单链或双链DNADNA和和RNARNA分分子中除去子中除去55磷酸基，即磷酸基，即脱磷酸作用脱磷酸作用。在基因工程中得到广泛使用的有两种：在基因工程中得到广泛使用的有两种：一种是一种是BAPBAP：从大肠杆菌中提取的从大肠杆菌中提取的另一种是另一种是CIPCIP：从牛小肠提取的。从牛小肠提取的。两种酶反应均需要两种酶反应均需要ZnZn2+2+。由于由于BAPBAP耐热，而耐热，而CIPCIP在在7070加热加热1010分钟或经酚抽提则失活；分钟或经酚抽提则失活；CIPCIP的特异的特异活性较活性较BAPBAP高高10-2010-20倍，因此，倍，因此，CIPCIP应用更广泛。应用更广泛。l主要用途：主要用途：去除去除DNADNA和和RNARNA的的55磷酸基，产生磷酸基，产生55羟基末端，羟基末端，然后在然后在T T4 4多聚核苷酸激酶催化下，用多聚核苷酸激酶催化下，用-3232PATPPATP进行末端标记，继而进行序列分析；进行末端标记，继而进行序列分析；去除载体去除载体DNADNA两末端的两末端的55磷酸基，防止载体磷酸基，防止载体DNADNA自我环化，提高自我环化，提高DNADNA重组率。重组率。5.S15.S1核酸酶核酸酶是一种特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链是一种特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNADNA和单链和单链RNARNA，不能降解其双链，不能降解其双链DNADNA或或RNARNA的杂的杂合子。合子。l主要用途主要用途：去除去除DNADNA片段的单链突出端，使之成为平端；片段的单链突出端，使之成为平端；去除去除cDNAcDNA合成时形成的发夹结构；合成时形成的发夹结构；进行进行S1S1核酸酶保护试验，分析转录产物；核酸酶保护试验，分析转录产物；成熟成熟 mRNAmRNA与基因组与基因组DNADNA杂交后，结合杂交后，结合S1S1核酸酶水核酸酶水解，可确定内含子在基因组解，可确定内含子在基因组DNADNA中的定位；中的定位；修整渐进性删除突变的末端。修整渐进性删除突变的末端。6.6.逆转录酶逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录酶又称依赖逆转录酶又称依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。该酶催化以单链该酶催化以单链RNARNA为模板生成双链为模板生成双链DNADNA的反的反应。应。由于这一反应中的遗传信息的流动方向正好由于这一反应中的遗传信息的流动方向正好与绝大多数生物转录生成方向与绝大多数生物转录生成方向(即以即以DNADNA为模板为模板转录生成转录生成RNARNA的方向的方向)相反，所以此反应称为逆相反，所以此反应称为逆转录作用。转录作用。l逆转录酶具有三种活性：逆转录酶具有三种活性：RNARNA指导的指导的DNADNA合成反应；合成反应；DNADNA指导的指导的DNADNA合成的反应；合成的反应；RNARNA的水解反应。的水解反应。二、基因工程载体二、基因工程载体理想的基因工程载体应具备以下特征：理想的基因工程载体应具备以下特征：(1)(1)能在宿主细胞内进行独立和稳定的能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNADNA自我自我复制。在外源复制。在外源DNADNA插入其插入其DNADNA之后，仍能保持稳之后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性。定的复制状态和遗传特性。(2)(2)易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。（3 3）在其）在其DNADNA序列中有适当的序列中有适当的限制性内切酶单限制性内切酶单一酶切位点一酶切位点，这些位点位于，这些位点位于DNADNA复制的非必需复制的非必需区内区内，可以在这些位点上插入外源，可以在这些位点上插入外源DNADNA，但不，但不影响载体自身影响载体自身DNADNA的复制。的复制。(4)4)具有能够直接观察的表型特征，在插入外具有能够直接观察的表型特征，在插入外源源DNADNA后，这些特征可以作为重组后，这些特征可以作为重组DNADNA选择的选择的标志。标志。l常见的基因载体有常见的基因载体有：细菌质粒载体细菌质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯氏质粒载体柯氏质粒载体病毒载体病毒载体 等等 （一）质粒载体（一）质粒载体(plasmid)质粒：质粒：是存在于染色体外能独立复制，稳是存在于染色体外能独立复制，稳定遗传的一种环状双链定遗传的一种环状双链DNADNA分子分子。质粒质粒DNADNA分子可持续稳定地处于染色体外的分子可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在特定情况下又会可逆地整合游离状态，但在特定情况下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到子一代。并通过细胞分裂传递到子一代。质质粒广泛分布于原核生物细胞中，也存在于粒广泛分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞中。一个细胞内质粒的数量变化某些真核细胞中。一个细胞内质粒的数量变化很大，有一至几个，也有几十个，甚至数百个。很大，有一至几个，也有几十个，甚至数百个。质粒的大小差异很大，小的不到质粒的大小差异很大，小的不到1kb1kb，大的超过大的超过500kb500kb。几乎所有的细菌株系都含有质粒。几乎所有的细菌株系都含有质粒。l 质粒的类型质粒的类型 F F质粒质粒：携带帮助其自身从一个细胞转入另一个：携带帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息质粒细胞的信息质粒 R R质粒质粒：表达对一种抗生素抗性的质粒；：表达对一种抗生素抗性的质粒；降解质粒：降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径基因的质粒途径基因的质粒质粒的命名：质粒的命名：通常用一个小写的通常用一个小写的p p来代表质粒，而用一些英来代表质粒，而用一些英文缩写或数字来对这个质粒进行描述。文缩写或数字来对这个质粒进行描述。以以PBR322PBR322为例，为例，BRBR代表研究出这个质粒的代表研究出这个质粒的研究者研究者BoliBolivarvar和和RogigerusRogigerus，322322是与这两是与这两个科学家有关的数字编号。个科学家有关的数字编号。l构建一种质粒载体，对质粒通常有以下几个方构建一种质粒载体，对质粒通常有以下几个方面的要求：面的要求：（1 1）质粒载体的相对分子质量应尽可能小。）质粒载体的相对分子质量应尽可能小。（2 2）应该有用来克隆外源）应该有用来克隆外源DNADNA的单一的限制性的单一的限制性内切酶识别位点；内切酶识别位点；（3 3）应该有一个或多个选择标记基因。）应该有一个或多个选择标记基因。（5 5）具有复制起始点）具有复制起始点 （4 4）质粒拷贝数较高。）质粒拷贝数较高。n几种常用的质粒载体几种常用的质粒载体 1 1、质粒载体、质粒载体pBR322pBR3222 2、质粒载体、质粒载体pUCl9pUCl93 3、酵母质粒载体、酵母质粒载体4 4、农杆菌质粒栽体、农杆菌质粒栽体 (1)(1)土壤农杆菌土壤农杆菌TiTi质粒质粒(2)(2)土壤发根农杆菌土壤发根农杆菌RiRi质粒载体质粒载体（二）（二）噬菌体载体噬菌体载体 细菌质粒载体最大可以克隆的细菌质粒载体最大可以克隆的DNADNA片段一般在片段一般在10kb10kb左左右，若要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些右，若要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些的的DNADNA片段，为满足这一要求，人们把噬菌体发展成片段，为满足这一要求，人们把噬菌体发展成为一种克隆载体。为一种克隆载体。1.1.噬菌体的特点噬菌体的特点噬菌体噬菌体(phage)phage)：寄生在细菌中的病毒，又称细：寄生在细菌中的病毒，又称细菌病毒。噬菌体由蛋白质外壳和头部外壳内的菌病毒。噬菌体由蛋白质外壳和头部外壳内的DNADNA组组成成。噬菌体作为载体，可噬菌体作为载体，可插入插入101020kb20kb甚至更大的甚至更大的一段外源一段外源DNADNA片段。由于片段。由于噬菌体具有较高的增殖能噬菌体具有较高的增殖能力，有利于目的基因的扩力，有利于目的基因的扩增，从而成为当前基因工增，从而成为当前基因工程研究的重要载体之一。程研究的重要载体之一。其中其中噬菌体噬菌体就是目前基就是目前基因克隆中最常用的一种。因克隆中最常用的一种。2.2.噬菌体噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体，在其生活史中，它噬菌体是一种温和噬菌体，在其生活史中，它将将DNADNA注入大肠杆菌之后，可以进入溶注入大肠杆菌之后，可以进入溶菌和溶源菌和溶源两种两种循环。循环。当当噬菌体进入裂解循环，噬菌体进入裂解循环，20min20min后就可使宿主细后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约胞发生裂解，同时释放出大约100100个噬菌体颗粒。个噬菌体颗粒。当当噬菌体进入溶源循环，即噬菌体进入溶源循环，即注入的注入的DNADNA整合到大整合到大肠杆菌的染色体中，与染色体一起复制肠杆菌的染色体中，与染色体一起复制，而并不给，而并不给寄主带来任何危害。寄主带来任何危害。当在某种营养条件或是环境胁迫条件下，整合的当在某种营养条件或是环境胁迫条件下，整合的噬菌体噬菌体DNADNA可以被切割出来，进入裂解循环可以被切割出来，进入裂解循环 。噬菌体是一种噬菌体是一种线状双链分子线状双链分子，长约，长约50 kb50 kb，具有具有6060多个基因多个基因，基因组分几个不连续的区域，基因组分几个不连续的区域，噬菌体噬菌体DNADNA大约大约50 kb50 kb，其中大约其中大约20 kb20 kb对对于整合于整合/切割过程极为关键，切割过程极为关键，称为整合称为整合/切割切割（I/EI/E）区域。对于构建基因文库来说，可将区域。对于构建基因文库来说，可将这这20 kb DNA20 kb DNA片段去掉，强迫重组的片段去掉，强迫重组的噬菌体噬菌体进入裂解循环。进入裂解循环。3.M133.M13载体载体 M13M13载体载体：是一种细丝状的特异性的大