![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法.pdf
《基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法.pdf(4页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期0引言哺乳动物细胞冷冻的标准方法是将细胞置于含有 5%10%二甲基亚砜渊DMSO冤和一定比例血清的细胞保存液中袁于液氮中进行长期保存遥DMSO 是一种有机极性分子袁能够渗透入细胞袁在一定程度上通过调节冷冻过程中溶质浓度的增加来减轻细胞的受损程度1遥 同时袁DMSO 的存在可以减少细胞内部冰晶的形成袁从而减少细胞膜的机械破坏和细胞器的损伤2遥 而在细胞冻存液中添加一定比例的血清袁可以帮助细胞在冷冻和解冻过程中提供多种细胞生长因子尧蛋白质和营养物质袁以更好地保持细胞状
2、态和减少损伤遥 也因此袁自 20 世纪 50 年代开始袁该方法一直是细胞冻存领域的金标准方法遥随着技术的发展袁 对上述细胞冻存方法进行了更深入地研究和优化遥 例如袁DMSO 作为有机溶剂袁对细胞存在一定毒性袁 可诱导细胞凋亡或破坏细胞内酶活性袁 因此有研究使用包括抗冻蛋白尧 聚乙烯醇尧海藻糖尧脯氨酸尧高分子多聚物等在内的成分作为冻存保护剂渊Cryoprotectants袁CPAs冤袁以替代或减少 DMSO 的用量3-4遥 又例如袁由于血清中含有的动物源成分和成分的不确定性袁 研究使用其他蛋白替代血清袁进而研究无血清尧无蛋白的细胞冻存液5遥再例如袁传统细胞冻存都依赖于液氮的低温环境袁但液氮的使用
3、存在一定限制袁所以研究在-80益长期保存细胞的细胞冻存液袁以摆脱对液氮的依赖等等6遥上述研究方向中一种可能的思路是袁 利用细胞基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法姬莉莉1*石文迪2赵大力3孙玉4渊1.北京市怀柔区疾病预防控制中心北京101400曰2.北京亦泰生物技术有限公司曰3.吉林国际旅行卫生保健中心曰4.吉林省中医药科学研究院冤摘要院本文使用一种基于高分子聚合物的细胞保护剂渊CCM046冤冻存和复苏悬浮型 MDCK 细胞袁并探索开发一种更加便捷的流感病毒培养方法遥 结果显示袁CCM046 细胞冻存液可稳定的于-80条件下保存悬浮型 MDCK 细胞袁且细胞活力稳定袁可在
4、复苏后快速恢复细胞增殖遥 在细胞复苏 24 h 后进行攻毒实验袁培养 48 h 后所产生的流感病毒含量基本与持续培养的新鲜细胞相同袁初步证明该方法可用于建立一种快速尧便捷的使用 MDCK 细胞培养和分离流感病毒的技术方法遥关键词院悬浮型 MDCK 细胞曰细胞冻存曰细胞复苏曰流感病毒中图分类号院R183.1A method for cultivating and isolating influenza virus based oncryopreservation and rapid revival of MDCK cells cultured in suspensionJI Lili1*袁SHI
5、 Wendi2袁ZHAO Dali3袁SUN Yu4渊1.Huairou District Centers For Disease Control And Prevention袁Beijing袁101400袁China曰2.Beijing Yitai Biotech Co.袁Ltd.曰3.Jilin International Travel Health Care Center曰4.Jilin Province traditional Chinese medicine institute冤Abstract院MDCK cells cultured in suspension were subje
6、cted to cryopreservation and subsequent revival using a cryopreser-vation medium supplemented with high molecular weight polymers.This approach was employed to assess the feasibility ofdeveloping a streamlined procedure for cultivating influenza virus.The findings indicated that the cryopreservation
7、 solutioneffectively maintained the viability of MDCK cells cultured in suspension at-80 degrees Celsius袁ensuring consistent cell via-bility and enabling rapid cellular proliferation upon revival.Furthermore袁following a 48-hour influenza virus infection period袁the viral yield obtained from cells rec
8、overed 24 hours after cryopreservation was comparable to that from continuously cul-tured fresh cells.These preliminary findings imply that this method holds promise for the establishment of a rapid and ex-pedient protocol for both influenza virus cultivation and isolation袁built upon MDCK cell cultu
9、res.Keywords院MDCK cells cultured in suspension曰Cell cryopreservation曰Cell resuscitation曰Influenza virus第一作者渊通信作者冤E-mail院基金项目院海南省重点研发计划项目渊ZDYF2021SHFZ069冤收稿日期院2023-08-31窑56窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING冻存液中的高分子聚合物袁 在冷冻过程中通过化学方式在细胞表面形成一层高分子聚合物保护层袁该保护层可以减轻冷冻过程中溶液中形成
10、的冰晶对细胞膜所造成的机械性损伤袁从而实现在冷冻过程中对细胞的保护遥 同时袁这一保护机制也为在更高温度下袁例如-80益袁保存冻存的细胞提供了可能4袁7遥 CCM046细胞冻存液即是一种基于上述思路研发的细胞冻存液遥 该冻存液具有不含血清尧不含蛋白质尧成分简单明确等特点袁同时袁使用该细胞冻存液冻存的细胞袁可于-80益放置袁极大方便细胞冻存的储存和运输遥本文拟利用 CCM046 细胞冻存液冻存悬浮型MDCK 细胞渊后简称 MDCK-S冤袁并通过评估冻存前后细胞的存活率和细胞活力等指标袁 探索开发一种更加便捷的流感病毒培养流程的可能性遥1材料和方法1.1细胞培养悬浮型 MDCK 细胞渊MDCK 33
11、016PF冤使用编号为 CDM Lonza 00194243 的无血清培养基培养袁并添加双抗遥培养时使用摇床于 5%CO237益环境下袁转速为 125 r/min遥1.2细胞冻存和复苏将MDCK-S细胞培养至增值期袁浓度约为5伊106/mL袁使用新鲜培养基调整浓度至约 2.5耀3伊106/mL 后袁取10 mL袁175 g 离心 5 min遥 离心后去上清袁使用 1 mLCCM046 细胞冻存液重悬袁或者使用 1 mL 含有 10%DMSO 的无血清培养基重悬遥 重悬后加入到 1.8 mL细胞冻存管内袁于-80益冷冻过夜遥 使用 CCM046 细胞冻存液冻存的细胞袁于-80益保存遥 使用 DM
12、SO 冻存的细胞则转入液氮保存遥细胞复苏时袁取 1 管待复苏细胞袁立即于 37益温水中顺时针旋转细胞冻存管袁 直至细胞冻存管内细胞冻存液完全融化遥 之后将融化后的细胞冻存液加入到 10 mL 无血清培养基内袁混匀并使于 175 g离心 5 min遥 离心后去上清袁使用 10 mL 新鲜无血清培养基重悬遥 重悬后的细胞加入到 50 mL 体积的细胞培养管内袁使用摇床于 5%CO237益环境下培养袁转速 125 r/min遥 复苏后的细胞培养 24 h 后袁取 10 mL加入 40 mL 新鲜无血清培养基袁并转入 250 mL 细胞摇瓶中袁继续传代培养遥1.3细胞存活率测定使用台盼蓝染色对细胞存活
13、率进行计数遥 具体方法为院根据细胞生长情况对细胞进行稀释曰稀释后的细胞与 0.4%的台盼蓝溶液 1颐1 混合曰使用血球计数板对活细胞数尧死细胞数进行计数曰每个细胞样品取样 2 次袁分别计数袁最终结果取平均值遥 在进行数据分析时袁为方便不同次实验之间的结果对比袁将单次实验内冻存前细胞数定值为 100袁 复苏后和复苏24 h 后的细胞数根据其与冻存前细胞数的比值袁按100 的相应比例定值袁细胞死亡率=死细胞数/渊活细胞数+死细胞数冤伊100%遥1.4甲型流感病毒接种和检测取 1 株实验室保存的甲型流感病毒样本袁 向使用 CCM046 细胞冻存液冻存后复苏 24 h 的 MDCK-S细胞中接种 10
14、0 滋L遥 同时向细胞浓度相同的持续培养的 MDCK-S 细胞中接种 100 滋L 同一毒株袁作为对照组遥分别培养 2 d 后袁根据叶国家流感中心标准操作规程曳渊2007 版冤8袁收集培养上清袁提取核酸并使用实时荧光 RT-PCR 对甲型流感病毒 RNA 进行测定遥2结果与分析2.1 细胞冻存前后细胞数量的变化和细胞存活率评价MURRAY 等9研究指出袁细胞在冻存过程中袁如果仅评估复苏后细胞的存活率袁 则冻存液的实际保护效能有可能被高估袁 有必要同时对细胞冻存前后细胞数量进行测定袁评估细胞在冻存过程中的损失袁以便更加准确的判断细胞冻存液对细胞的保护情况遥 因此袁本实验对 MDCK-S 细胞在冻
15、存前尧复苏后和复苏后 24 h袁使用台盼蓝染色方法对 MDCK-S 细胞数量和细胞存活率进行测定并记录和分析遥 结果如图 1A 和图 1B遥图 1B注院图 1A 为 MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞数量的对比结果曰图 1B 为 MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞死亡率的对比结果遥图 1MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞数量和细胞死亡率的对比结果Fig.1Cell number and cell death rate of MDCK-S cellsbefore cryopreservation袁after revival袁and
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基于 悬浮 MDCK 细胞 快速 复苏 一种 流感病毒 培养 方法
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。