沉默CSE1L对急性髓系白...敏感性的影响及作用机制研究_刘小玉.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(2):269-275杂志网址:http:/沉默CSE1L对急性髓系白血病细胞阿糖胞苷敏感性的影响及作用机制研究*刘小玉1,李旭东2,关坤萍3(1山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,山西 太原 030001;2山西医科大学第二临床医学院,山西 太原 030001;3山西医科大学第二医院检验科,山西 太原 030001)摘要 目的:探讨敲减染色体分离1样蛋白(CSE1L)对急性髓系白血病细胞株THP-1细胞生物学行为及阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的影响,并分析相关作用机制。方法:采
2、用RT-qPCR法检测CSE1L的 mRNA表达水平,流式细胞术检测细胞周期及凋亡水平,LinkedOmics及DAVID数据库进行基因本体论(gene ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,Western blot法检测细胞周期素D1(cyclin D1)、原癌基因c-Myc、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的相对表达水平。结果:与对照组相比,空载(sh-NC)组及敲减(sh-CSE1L)组标记绿色荧光蛋白(GFP)的THP-1细胞占比均90%。与空载组相比,敲
3、减组CSE1L的mRNA相对表达量降低至40%,凋亡率显著升高(P0.01)。敲减组比空载组G0/G1期细胞占比升高(P0.05),S期细胞占比降低(P0.05),而G2/M期无明显差异。在1 mol/L阿糖胞苷处理24 h后,敲减组细胞活力最低(P0.05),凋亡率最高(P0.01)。此外,敲减CSE1L可下调Bcl-2、cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平,上调Bax蛋白表达水平(P0.05)。生物信息学分析显示CSE1L主要参与细胞周期等通路。结论:敲减CSE1L可阻滞THP-1细胞周期,诱导细胞凋亡,提高细胞对阿糖胞苷的敏感性,其可能通过调控细胞周期相关分子发挥作用。关键词 阿糖
4、胞苷;急性髓系白血病;染色体分离1样蛋白;细胞周期;细胞凋亡中图分类号 R733.71;R363.2 文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.009Effect of CSE1L silencing on cytarabine sensitivity of acute myeloid leukemia cellsLIU Xiaoyu1,LI Xudong2,GUAN Kunping3(1Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medicine,Shanxi
5、 Medical University,Taiyuan 030001,China;2The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;3Department of Laboratory,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China.E-mail:)ABSTRACT AIM:To investigate the effect of chromosome segregation 1-like(CSE1L)on bio
6、logical behavior and cytarabine(Ara-C)sensitivity of acute myeloid leukemia THP-1 cells,and to analyze its mechanism.METHODS:The THP-1 cells were divided into control group,negavtive control(sh-NC)group,sh-CSE1L group,sh-NC+Ara-C group,and sh-CSE1L+Ara-C group.The mRNA expression of CSE1L was detect
7、ed by RT-qPCR.Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry.Gene ontology(GO)functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis were performed by LinkedOmics and DAVID databases.The protein levels of cyclin D1,c-Myc,Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.RESULTS:The expressio
8、n of green fluorescent protein(GFP)was more than 90%in both the sh-NC and sh-CSE1L groups when compared with control group.Compared with sh-NC group,the mRNA expression level of CSE1L was reduced to 40%in sh-CSE1L group,and the apoptosis rate was significantly higher(P0.01).The cell cycle G0/G1 phas
9、e was significantly higher(P0.05),and the S phase was significantly lower(P0.05)in sh-CSE1L group than in sh-NC group,while there was no significant difference in G2/M phase.Cell viability was the lowest(P0.05)and apoptosis was the highest(P0.01)in sh-CSE1L group after treated with Ara-C.In addition
10、,silencing of CSE1L down-regulated Bcl-2,cyclin D1 and c-Myc protein levels(P0.05),but up-regulated Bax protein level(P0.05).Bioinfor文章编号 1000-4718(2023)02-0269-07 收稿日期 2022-09-06 修回日期 2022-11-30*基金项目 山西省重点研发计划项目(No.201903D321093)通讯作者 Tel:13700514558;E-mail:269matic analysis concluded that CSE1L is
11、mainly involved in the cell cycle and other pathways.CONCLUSION:Knockdown of CSE1L blocks THP-1 cell cycle,induces apoptosis,and improves the sensitivity to Ara-C,which may act by regulating cell cycle-related molecules.KEY WORDS cytarabine;acute myeloid leukemia;chromosome segregation 1-like;cell c
12、ycle;apoptosis急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种骨髓髓系细胞分化受阻,正常血细胞生成受抑制而引发的严重血液学疾病1。以阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)为代表的化疗药物是一种抑制 DNA复制的嘧啶类似物,是治疗AML的主要药物2-3。常规剂量的阿糖胞苷可使AML缓解率超过70%,然而超过60%的AML患者复发4-5。高剂量阿糖胞苷强化治疗可提高 AML 患者的总体生存率、降低复发率,但增加了药物的副作用6。染色体分离1样蛋白(chromosome segregation 1-like,CSE1L),又称为细胞凋亡易感基因(cel
13、lular apoptosis susceptible,CAS),位于人染色体20q13,分子量为110 kD7。CSE1L作为一种核转运因子,参与多种细胞功能,包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、微囊形成及肿瘤转移等8-10。据报道,CSE1L在多种实体瘤中高表达,包括肺癌、乳腺癌和胃癌等11-14。本课题组前期研究证实CSE1L在AML患者骨髓组织中高表达,且与患者的不良预后相关15,但其与阿糖胞苷化疗敏感性的关系及作用机制尚不明确。本研究以急性髓系白血病 THP-1 细胞为模型,进一步探讨 CSE1L 对 THP-1细胞周期和凋亡的影响,及其与阿糖胞苷敏感性的关系,为提高阿糖胞苷敏感性提供
14、理论依据。材料和方法1实验材料和试剂细胞周期及凋亡试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司;阿糖胞苷购自阿拉丁生物公司;抗 c-Myc、细胞周期素D1(cyclin D1)、Bcl-2及Bax抗体购自万类生物科技有限公司;抗-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;抗CSE1L抗体购自Abcam;RPMI-1640购自 Gibco;特级胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;携带HBLV-h-CSE1L shRNA1-ZsGreen-Puro的sh-CSE1L 慢病毒和携带 HBLV-ZsGreen-Puro 的无义表达sh-NC慢病毒由上海
15、汉恒生物科技有限公司设计并合成。2实验方法2.1数据来源及生物信息学分析基于 LinkedOmics(http:/www.linkedomics.org/)数据库在线分析CSE1L正相关的基因,并通过DAVID(https:/david.ncifcrf.gov/home.jsp)在线网站进行相关基因分析,以P0为阈值筛选,进行基因本体论(gene ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。2.2细胞培养及分组THP-1细胞株由山西医科大学第二医院血液中心实验室赠送。THP-
16、1细胞使用RPMI-1640培养基(含10%FBS及1%青霉素和链霉素),在37、5%CO2的培养箱中培养。细胞分为5组:(1)对照(control)组:未经任何处理的THP-1细胞;(2)空载(sh-NC)组:携带空载体的慢病毒感染THP-1 细胞;(3)敲减(sh-CSE1L)组:携带 CSE1L 干扰基因的慢病毒感染 THP-1 细胞;(4)sh-NC+Ara-C组:经 1 mol/L 阿糖胞苷16处理 24 h 的 sh-NC 组THP-1 细胞;(5)sh-CSE1L+Ara-C 组:经 1 mol/L 阿糖胞苷处理24 h的sh-CSE1L组THP-1 细胞。2.3CCK-8 法检
17、测细胞活力分别接种 8 000 个THP-1细胞到 96孔细胞培养板,并将处理组加入 1 mol/L 阿糖胞苷。24 h 后,向每孔中加入 10 L CCK-8试剂。在孵箱孵育2 h后,用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度(A)值。计算细胞活力,细胞活力(%)=(A加药组A空白组)/(A对照组A空白组)100%。2.4Western blot检测蛋白表达水平收集一定数量 THP-1 细胞,使用 RIPA 强裂解液裂解细胞。30 min后,在4、12 000 r/min条件下离心15 min。收集上清液,使用BCA法测蛋白浓度,随后100 变性蛋白 5 min。取 30 g 总蛋白经电泳分离后
18、转移到0.45 m的PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h 后,加入抗 4 孵育过夜。抗孵育 1 h 后,ECL曝光检测相应蛋白的表达信号。用ImageJ软件进行蛋白条带灰度值分析。2.5RT-qPCR 检测 mRNA 表达水平收集一定数量THP-1细胞,用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。测定总RNA浓度后,利用反转录试剂盒将RNA反转录为 cDNA。以此 cDNA 为模板,设定 RT-qPCR 程序:95 30 s;95 5 s,60 34 s,40 个循环;95 15 s,60 1 min,95 15 s。CSE1L的上游引物序列为5-ATTAAGCTTGTTCTGGATGCC
19、TTTG-3,下游引物序列为 5-GAGGCATTTGCATGGGTA-3;内参照-actin的上游引物序列为5-TGGCACCCAG270CACAATGAA-3,下 游 引 物 序 列 为 5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3。采用2Ct法进行数据分析。2.6DNA含量法检测细胞周期收集一定数量的THP-1细胞,预冷PBS洗涤2次后,加入70%预冷乙醇 4 固定过夜。预冷 PBS洗去固定液,然后加入100 L RNaseA 溶液在 37 水浴,30 min 后,加入400 L PI溶液,4 避光孵育 30 min。最后在波长488 nm处上机检测。2.7Annexin
20、V-PE/7-AAD 双染法检测细胞凋亡收集一定数量的THP-1细胞,预冷PBS洗涤2次后,用去离子水按1 3稀释结合缓冲液重悬细胞。加入5 L Annexin V/PE 溶液,混匀后在室温避光孵育 5 min。然后加入 10 L 7-AAD 溶液,并加 400 L PBS,立刻进行流式检测。3统计学处理用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8进行统计分析及作图。两基因的相关性使用Pearson相关分析。计量资料以均数标准差(meanSD)表示。组间比较采用t检验或U检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1用慢病毒载体携带shRNA-CSE1L构建急性髓系白血病细胞模型的效果
21、前期,同课题组成员已通过免疫组化实验证实CSE1L在急性髓系白血病中高表达15。本研究以急性髓系白血病 THP-1 细胞为模型进一步探讨敲减CSE1L对 THP-1细胞周期、凋亡的影响及其与阿糖胞苷敏感性的关系。经嘌呤霉素筛选的空载组及敲减组THP-1细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达水平均大于 90%(图 1A),提示慢病毒感染效果较好。RT-qPCR结果显示,与空载组相比,敲减组细胞CSE1L的mRNA水平降低到40%(图1B),提示CSE1L敲减效果较好。2敲减CSE1L对THP-1细胞周期的影响流式细胞术结果显示,与空载组相比,敲减组G0
22、/G1期细胞占比升高(P0.05),S期细胞占比降低(P0.05),G2/M期无显著差异(图2A)。Western blot结果显示,与空载组相比,敲减组cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平均显著降低(P0.05 或 P0.01),见图2B。3敲减CSE1L对THP-1细胞凋亡的影响流式细胞凋亡检测结果显示,与空载组相比,敲减组凋亡率显著高于空载组(P0.01),见图 3A。Western blot结果显示,与空载组相比,敲减组Bax蛋白相对表达水平显著升高(P0.05),而Bcl-2蛋白显著降低(P0.05),见图3B。4各组细胞经阿糖胞苷处理后细胞活力及凋亡率Figure 1.Est
23、ablishment of a stably transfected cell line of CSE1L knockdown THP-1 cells.A:flow cytometry was used to detect the expression of GFP;B:the knockdown efficiency of sh-CSE1L was verified by RT-qPCR.图1CSE1L敲减THP-1细胞稳定转染细胞株的建立271的比较细胞活力结果显示,经阿糖胞苷处理的敲减组细胞活力最低(P0.05),见图4A。流式细胞凋亡实验结果显示,经阿糖胞苷处理的敲减组细胞,凋亡率显著
24、高于其他组(P0.01),见图4B。5GO功能注释和KEGG通路富集分析基于LinkedOmics数据库,筛选出与CSE1L正相关的基因5 044个,选择前50个作图(图5A)。基于Figure 2.Effect of CSE1L knockdown on THP-1 cell cycle.A:knockdown of CSE1L blocked the THP-1 cell cycle;B:effect of CSE1L knockdown on the protein expression levels of cyclin D1 and c-Myc in THP-1 cells.MeanS
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