wrl基因工程-463.ppt

wrlwrl基因工基因工程程考考纲解解读1.基因工程概念1.DNA重组技术的基本工具2.基因工程的基本操作程序考向指南考向指南基因工程是生物工程的主要领域，常与其他技术组合运用而达到定向改造生物的目的。试题中一般以具体实例对基因工程的概念、基本工具、操作过程等进行考查，如2010年高考就侧重于基因工程有关知识的考查。上海卷、江苏卷、全国2卷、广东卷等都有考题出现。一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象 操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果1 1 1 1、原理：、原理：、原理：、原理：基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术重组技术重组技术生物体外生物体外生物体外生物体外基基基基 因因因因DNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平剪切剪切剪切剪切拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入表达表达表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物考点归纳考点归纳1(2010全国全国，5)下列叙述符合基因工程概念的是下列叙述符合基因工程概念的是 ()AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴淋巴细胞中的抗体基因细胞中的抗体基因 B将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干能产生人干 扰素的菌株扰素的菌株 C用紫外线照射青霉菌，使其用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株获得青霉素高产菌株 D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整整合到细菌合到细菌DNA上上解析解析：基因工程是在生物体外，通过对基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使目的基因在受体细胞内表达，导入受体细胞内进行无性繁殖，使目的基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。所以产生出人类所需要的基因产物。所以B为基因工程，而为基因工程，而A为动为动物细胞工程，物细胞工程，C为诱变育种，为诱变育种，D无人为因素不属于基因工程。无人为因素不属于基因工程。答案：答案：B2基因工程的基本工具的比较基因工程的基本工具的比较限制限制酶酶DNA连连接接酶酶载载体体作用作用作用作用部位部位作用作用特点特点(条件条件)常用常用类类型型切割目的基因和载体切割目的基因和载体拼接拼接DNA片段，形成重片段，形成重组组DNA两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键酯键(1)识别特定的核苷识别特定的核苷酸序列酸序列(2)在特定位点上切在特定位点上切割割(1)EcoliDNA连接酶连接酶只能连接黏性末端只能连接黏性末端(2)T4DNA连接酶能连连接酶能连接黏性末端和平末端接黏性末端和平末端EcoR限制酶限制酶Sma限制酶限制酶EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶携带目的基因携带目的基因进入受体细胞进入受体细胞(1)能在宿主细胞内稳能在宿主细胞内稳定存在并大量复制定存在并大量复制(2)有多个限制酶切割有多个限制酶切割位点位点(3)具有特殊的标记基具有特殊的标记基因因质粒、质粒、噬菌体的衍生噬菌体的衍生物、动植物病毒物、动植物病毒考点归纳考点归纳限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶-“分子手术刀分子手术刀”DNADNA连接酶连接酶-“-“分子缝合针分子缝合针”2(2010江苏生物，江苏生物，27)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图图1、图、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制限制酶酶BamHHindEcoRSma识别识别序列及序列及切割位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATT CC TTAAGCCCGGGGGGCCC(1)(1)一个图一个图1 1所示的质粒分子经所示的质粒分子经SmaSma切割前后，分别含有切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(3)(3)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNADNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma Sma 切割，原因是切割，原因是_ _ 。(4)(4)与只使用与只使用EcoREcoR相比较，使用相比较，使用BmaHBmaH和和HindHind两种限两种限制酶同时处理质粒、外源制酶同时处理质粒、外源DNADNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止_ _ 0、2Sma会破坏质粒的抗性基因和外源会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因中的目的基因 质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入并加入_酶。酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_ 。(7)为了从为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。表达的初步检测。DNA连接连接鉴别和筛选含有目的基因鉴别和筛选含有目的基因的细胞的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质 解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)(1)质粒是双链环状质粒是双链环状DNADNA分分子，在子，在SmaSma切割前没有游离的磷酸基团，切割前没有游离的磷酸基团，SmaSma作用于两个核苷酸之作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的间的磷酸二酯键，切割产生的DNADNA片段末端是平末端，因而质粒经切割片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有后含有2 2个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(3)(3)据图据图1 1可知，可知，SmaSma切割的位点在抗生切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2 2可知可知SmaSma切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用SmaSma切割。切割。(4)(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。(5)(5)基因表达载体的构建过程中需加基因表达载体的构建过程中需加DNADNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。(7)(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖而可在含有蔗糖(唯一碳源唯一碳源)的培养基中培养。的培养基中培养。1.1.1.1.目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获获取取取取2.2.2.2.基因表达基因表达基因表达基因表达载载体的构建体的构建体的构建体的构建3.3.3.3.将目的基因将目的基因将目的基因将目的基因导导入受体入受体入受体入受体细细胞胞胞胞4.4.4.4.目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的检测检测与与与与鉴鉴定定定定二、基本步骤：二、基本步骤：二、基本步骤：二、基本步骤：考点归纳考点归纳1.1.目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取常用方法：常用方法：从基因文从基因文从基因文从基因文库获库获取目的基因取目的基因取目的基因取目的基因基因基因组文文库（一种生物的（一种生物的所有基因所有基因）部分基因文部分基因文库：如：如cDNA文文库（部分基因部分基因）利用利用利用利用PCRPCR技技技技术扩术扩增目的基因增目的基因增目的基因增目的基因原理：生物体外原理：生物体外原理：生物体外原理：生物体外DNADNA双双双双链链复制的原理复制的原理复制的原理复制的原理通通通通过过DNADNA合成合成合成合成仪仪直接人工合成直接人工合成直接人工合成直接人工合成基因基因基因基因较较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。小，核苷酸序列已知，可以人工合成。小，核苷酸序列已知，可以人工合成。小，核苷酸序列已知，可以人工合成。考点归纳考点归纳启启动子子终止子止子目的基因目的基因标记基因基因2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的：是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可目的：是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代以遗传给下一代(核心）核心）3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因目的基因目的基因目的基因进进入受体入受体入受体入受体细细胞内，并且在受体胞内，并且在受体胞内，并且在受体胞内，并且在受体细细胞内胞内胞内胞内维维持持持持稳稳定和表达的定和表达的定和表达的定和表达的过过程（叫程（叫程（叫程（叫转转化）。化）。化）。化）。3.将目的基因导入受体细胞中的方法的比较将目的基因导入受体细胞中的方法的比较生物种生物种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞常用方法常用方法受体受体细细胞胞转转化化过过程程农杆菌转化法农杆菌转化法,基因基因枪法，花粉管通道法枪法，花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2Ca2处理法处理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导导入植物细胞入植物细胞整合到受整合到受体细胞的染色体体细胞的染色体DNADNA表达表达目的基因表达载体目的基因表达载体提纯提纯取卵取卵(受精受精卵卵)显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育获得获得具有新性状的动物具有新性状的动物Ca2Ca2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNADNA分子分子4.目的基因的检测内容和方法的比较目的基因的检测内容和方法的比较类类型型步步骤骤检测检测内容内容方法方法结结果果显显示示分子水平分子水平检测检测第一步第一步第二步第二步第三步第三步个体水平个体水平鉴鉴定定目的基因是否插入目的基因是否插入受体细胞染色体的受体细胞染色体的DNA上上DNA分子杂交分子杂交技术技术(DNA和和DNA之间之间)是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNA核酸分子杂交核酸分子杂交技术技术(DNA和和mRNA之间之间)同上同上目的基因是否翻译目的基因是否翻译出蛋白质出蛋白质蛋白质分子杂交蛋白质分子杂交(抗原抗原抗体之抗体之间间)同上同上包括抗虫或抗病的接种实验；基因工程产品与天然产品进包括抗虫或抗病的接种实验；基因工程产品与天然产品进行活性比较，以确定功能是否相同等行活性比较，以确定功能是否相同等3(20102010浙江理综，浙江理综，2 2)在用基因工程技术构建抗除草剂的在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是转基因烟草过程中，下列操作错误的是 ()A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B用用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C将重组将重组DNA分子导入烟草原生质体分子导入烟草原生质体 D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞解析：限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒解析：限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒的遗传物质是的遗传物质是RNARNA，不能用限制性核酸内切酶切割，不能用限制性核酸内切酶切割，A A项错误；项错误；DNADNA连接酶连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，B B项正确；受体细胞可以项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，C C项正确；项正确；目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D D项正确。项正确。答案：答案：A A4 4(2011(2011年四川卷）北极比目年四川卷）北极比目鱼鱼中有抗中有抗冻冻基因，其基因，其编码编码的的抗抗冻冻蛋白具有蛋白具有1111个氨基酸的重复序列，个氨基酸的重复序列，该该序列重复次数越序列重复次数越多，抗多，抗冻冻能力越能力越强强，下，下图图是是获获取取转转基因抗基因抗冻冻番茄植株的番茄植株的过过程示意程示意图图，有关叙述正确的是，有关叙述正确的是A A过程程获取的目的基因，可用于基因工程和比目取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基基因因组测序序B B多个抗多个抗冻基因基因编码区依次相区依次相连成能表达的新基因，不成能表达的新基因，不能得到抗能得到抗冻性增性增强的抗的抗冻蛋白，蛋白，C C过程程构成的重构成的重组质粒缺乏粒缺乏标记基因，需要基因，需要转入入农杆杆菌才能菌才能进行行筛选D D应用用DNADNA探探针技技术，可以，可以检测转基因抗基因抗冻番茄植株中目番茄植株中目的基因的存在及其完全表达的基因的存在及其完全表达 解析：解析：过过程程1 1获获得的目的基因已不含非得的目的基因已不含非编码编码区和内含子，因此不区和内含子，因此不能用于比目能用于比目鱼鱼基因基因组测组测序，因此序，因此A A错错。导导入入农农杆菌是杆菌是为为了了扩扩增和更易增和更易导导入蕃茄入蕃茄细细胞，胞，C C错错。DNADNA探探针针技技术术不能不能检测检测基因是基因是否完全表达，目的基因的完全表达否完全表达，目的基因的完全表达应该检测应该检测表达表达产产物蛋白物蛋白质质，D D错错。答案：答案：B B5 5.（1111年山年山东东卷）卷）35.35.（8 8分）分）人人类类疾病的疾病的转转基因基因动动物模型常用于致病机理的探物模型常用于致病机理的探讨讨及治及治疗疗药药物的物的筛选筛选。利用正常大鼠制。利用正常大鼠制备遗传备遗传性高血性高血压转压转基因模型大基因模型大鼠的流程如鼠的流程如图图所示。所示。（1 1）卵母）卵母细细胞除从活体胞除从活体输输卵管中采集外，卵管中采集外，还还可以从可以从处处死死的雌鼠的雌鼠_中中获获取。取。（2 2）图图中的高血中的高血压压相关基因作相关基因作为为_，质质粒作粒作为为_,_,二者需用二者需用_ 切割后切割后连连接成重接成重组载组载体，体，该过该过程与程与质质粒上含有粒上含有_有关。有关。卵巢卵巢目的基因目的基因载载体体同种限制同种限制酶酶 限制限制酶酶切割点切割点（3 3）子代大鼠如果）子代大鼠如果_和和_，即可分即可分别别在水平上在水平上说说明高血明高血压压相关基因已成功表达，然相关基因已成功表达，然后可用其建立高血后可用其建立高血压转压转基因基因动动物模型。物模型。（4 4）在上述）在上述转转基因大鼠的培育基因大鼠的培育过过程中，所用到的主要胚胎程中，所用到的主要胚胎工程技工程技术术是是_、早期胚胎培养和胚胎移植。、早期胚胎培养和胚胎移植。答案：（答案：（1 1）卵巢）卵巢（2 2）目的基因目的基因 载载体体 同种限制性核酸内切同种限制性核酸内切酶酶（或同种限制（或同种限制酶酶）限制限制酶酶切割位点切割位点（3 3）检测检测到体内有相关蛋白到体内有相关蛋白 出出现现高血高血压压（4 4）体外受精）体外受精检测检测到体内有相关蛋白到体内有相关蛋白出出现现高血高血压压体外受精体外受精5(2010天津理综，天津理综，7节选节选)下图是培育表达人乳铁蛋白下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性表示四环素抗性基因，基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所示为三种限制酶的酶切位点。直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：据图回答：(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是是_(填字母代号填字母代号)。A启动子启动子 BtetR C复制原点复制原点 DampR(3)过程过程可采用的操作方法是可采用的操作方法是_(填字母代号填字母代号)。A农杆菌转化农杆菌转化 B大肠杆菌转化大肠杆菌转化C显微注射显微注射 D细胞融合细胞融合Hind和和BamH 氨苄青霉素氨苄青霉素 A C(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号填字母代号)技术。技术。A核酸分子杂交核酸分子杂交 B基因序列分析基因序列分析C抗原抗原抗体杂交抗体杂交 DPCRC 解析解析：(1)由图示可知：需用由图示可知：需用Hind和和BamH限制酶同时限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后tetR四环素抗性基四环素抗性基因结构被破坏而因结构被破坏而ampR结构完好，故用含氨苄青霉素的选择结构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段启动子是一段特殊的特殊的DNA序列，是序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可调聚合酶识别和结合的位点，可调控基因的特异性表达。控基因的特异性表达。(3)过程过程表示把重组载体导入受体表示把重组载体导入受体细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。法。(6)人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白，可用抗原达产物即人乳铁蛋白，可用抗原抗体杂交法检测该蛋白抗体杂交法检测该蛋白是否存在。是否存在。