基因诊断.ppt
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1、基因诊断基因诊断疾病的诊断依据疾病的诊断依据u 实验室诊断技术:实验室诊断技术:细胞学检查细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验免疫学检验 基因诊断基因诊断u临床表现临床表现2*OpeningCeremonyofthe2008BeijingParalympicsonSep6th,2008GJB2GJB2基因基因线粒体基因突变(发生频率最高的为线粒体基因突变(发生频率最高的为A1555GA1555G突变)突变)PDSPDS基因基因Sign Language Performance:Hello Star We are different4*5*
2、Disease6*?7*一致的遗传信息一致的遗传信息一致的表型?一致的表型?英国同卵双胞胎命运迥然不同英国同卵双胞胎命运迥然不同*8奥利维亚和伊莎贝拉奥利维亚和伊莎贝拉相同的基因型相同的基因型相同的基因型相同的基因型 不同的表现型不同的表现型不同的表现型不同的表现型 基因表达模式基因表达模式基因表达模式基因表达模式9 9表观遗传学表观遗传学9*表观遗传学的研究内容表观遗传学的研究内容概 述l基因转录后的调控基因转录后的调控u基因组中非编码基因组中非编码RNARNAu微小微小RNARNA(miRNAmiRNA)u反义反义RNARNAu内含子、核糖开关等内含子、核糖开关等l基因选择性转录表达基因选
3、择性转录表达的调控的调控uDNADNA甲基化甲基化u基因印记基因印记u组蛋白共价修饰组蛋白共价修饰u染色质重塑染色质重塑10*主要内容主要内容基因诊断的概念基因诊断的概念基因诊断技术基因诊断技术基因诊断的应用基因诊断的应用基因诊断的定义基因诊断的定义 采用分子生物学方法(采用分子生物学方法(核酸分子杂交核酸分子杂交、PCRPCR等技术)在等技术)在基因基因(DNADNA)水平)水平及及转录水平转录水平对对基因的结构基因的结构和和功能功能进行分析,从而对特定进行分析,从而对特定的疾病进行诊断,因此基因诊断至少包括的疾病进行诊断,因此基因诊断至少包括DNADNA诊断和诊断和RNARNA诊断两大部诊
4、断两大部分。分。DNADNA诊断诊断检测特定基因的检测特定基因的DNADNA序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况,及序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况,及特定特定DNADNA的拷贝数。分析的拷贝数。分析静态静态的基因结构。的基因结构。RNARNA诊断诊断对待测基因转录物(对待测基因转录物(RNARNA)进行定量,检测其剪接和加工的缺陷,以及外)进行定量,检测其剪接和加工的缺陷,以及外显子的变异等等。分析显子的变异等等。分析动态动态的基因表达。的基因表达。12*意义意义 l 逆向诊断(逆向诊断(reverse diagnosisreverse diagnosis):和传统的诊断方和
5、传统的诊断方法主要差异在于法主要差异在于直接从基因型推断表型直接从基因型推断表型,即可以越过产物,即可以越过产物(酶和蛋白质)(酶和蛋白质)直接检测基因结构而作出诊断直接检测基因结构而作出诊断,这样就改变,这样就改变了传统的表型诊断方式,故基因诊断又称为了传统的表型诊断方式,故基因诊断又称为逆向诊断逆向诊断(reverse diagnosisreverse diagnosis)。l症状前诊断症状前诊断l预测疾病的易感者和检测携带者预测疾病的易感者和检测携带者l产前诊断产前诊断13*基因变异致病的类型基因变异致病的类型内源基因的变异内源基因的变异l基因结构的突变基因结构的突变 点突变、插入、缺失
6、、重排、易位点突变、插入、缺失、重排、易位l基因表达异常基因表达异常 mRNAmRNA剪接异常剪接异常外源基因的插入外源基因的插入14*基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现:基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现:(一)影响其产物组成或结构(一)影响其产物组成或结构(二)影响其表达的量(二)影响其表达的量 基因突变改变表达产物的基因突变改变表达产物的“质质”和和“量量”引起疾病引起疾病(一一)基因突变改变表达产物组成和结构基因突变改变表达产物组成和结构同义突变同义突变 (cosense mutationcosense mutation):基因突变基因突变只在非关键
7、只在非关键的部位发生,如在密码子第的部位发生,如在密码子第3 3位由于简并性而发生位由于简并性而发生的并的并不会改变氨基酸不会改变氨基酸,也不影响其产物的生物学活,也不影响其产物的生物学活性和性质性和性质碱基置换突变碱基置换突变 17错义突变错义突变 (missense mutation)(missense mutation):碱基置换碱基置换发生在密码子上,发生在密码子上,改变其相对应的氨基酸类改变其相对应的氨基酸类型。型。如果被改变的氨基酸位于多肽链的关键部分,如如果被改变的氨基酸位于多肽链的关键部分,如活性中心、催化中心或分子结合部位,则有可能改变活性中心、催化中心或分子结合部位,则有可
8、能改变这一产物的生物学活性和作用,改变的程度则视具体这一产物的生物学活性和作用,改变的程度则视具体情况而定。情况而定。*18无义突变无义突变(nonsense mutation)(nonsense mutation):基因突变基因突变在本来不是在本来不是终止密码处终止密码处产生终止密码产生终止密码,即所谓,会使基因表达,即所谓,会使基因表达产生的多肽链缩短,失去或大大减弱肽链的功能。产生的多肽链缩短,失去或大大减弱肽链的功能。*终终止止密密码码突突变变(termination termination codon codon mutationmutation):突突变变在在原原来来终终止止密密码
9、码处处产产生生非非终终止止密密码码,变变成成编编码码氨氨基基酸酸密密码码,叫叫做做则则其其表表达达产产物物多多肽肽链链会会延延长长,也也会会失失去或大大减弱正常多肽链的功能。去或大大减弱正常多肽链的功能。移移码码突突变变(frame-shift frame-shift mutationmutation):当当基基因因核核苷苷酸酸序序列列插插入入或或丢丢失失1 1个个、2 2个个或或不不构构成成三三联联体体密密码码或或其其倍倍数数的的多多个个碱碱基基后后,在在插插入入或或丢丢失失部部位位后后面面的的三三联联体体密密码码会会发发生生移移码码,造造成成其其表表达达的的多多肽肽链链截截短短或或延延长长
10、,从从而而丧丧失失或或大大大大减减弱弱正正常常多肽链的功能。多肽链的功能。碱基缺失和插入突变碱基缺失和插入突变数目变异的串联重复数目变异的串联重复(Variable number tandem repeats)20*脆性脆性x综合症就是由于三核苷酸(综合症就是由于三核苷酸(CCG)n重复序列的拷贝数增加所致重复序列的拷贝数增加所致染色体易位染色体易位(Translocation)21*Abnornal Processing of the Globin primary RNA Transcript剪切位点的突变剪切位点的突变22*有不少有不少疾病基因本身并无突变发生疾病基因本身并无突变发生,但,
11、但调控调控疾病基因的基因发生了突变疾病基因的基因发生了突变,这些突变可以发挥,这些突变可以发挥正调控作用,也可以发挥负调控作用,正调控作用,也可以发挥负调控作用,其产物通其产物通过改变疾病基因的表达程度过改变疾病基因的表达程度而引起相应表型的改而引起相应表型的改变。变。如如某某些些酶酶基基因因表表达达缺缺失失或或过过量量引引起起的的遗遗传传性性疾病就是这种情况。疾病就是这种情况。(二二)基因突变改变基因表达水平基因突变改变基因表达水平uBlood samples-the most widely used source of DNA from adults.uMouthwashes or buc
12、cal scrapes-being noninvasive,they are especially favored for population screening programs.Mouthwashes yield sufficient DNA for a few dozen tests,and by using whole genome amplification more extensive testing of a single sample may be possible.uChorionic villus biopsy samples-the best source of fet
13、al DNA(better than amniocentesis specimens).uOne or two cells removed from eight-cell stage embryos,for pre-implantation diagnosis after in vitro fertilization.uHair,semen,etc.for criminal investigations.uArchived pathological specimens,for typing dead people when no DNA has been stored,or testing t
14、umors for genetic changes.Only short sequences,250 bp or less,can be reliably amplified from fixed tissue specimens.uGuthrie cards-these are the cards on which a spot of dried blood is sent to a laboratory for neonatal screening for phenylketonuria(PKU)in the UK and elsewhere;not all the blood spot
15、is used for the screening test.They are a possible source of DNA from a dead child.Samples required for genetic testing24*基因诊断的特点基因诊断的特点u高敏感性高敏感性u高特异性高特异性u适用性强适用性强u早期诊断早期诊断25*Methods and techniques used in genetic testing基因诊断的方法和技术基因诊断的方法和技术u Mutation scanning technologies u Mutation Screening techn
16、ologies u Fluorescent-energy transfer techniques 27*Polymerase Chain Reaction(PCR)Polymerase Chain Reaction Kary Banks Mullis Kary received a Nobel Prize in chemistry in 1993 Michael Smith 28*PCR简单重复序列区间扩增简单重复序列区间扩增 指数后线性扩指数后线性扩增增PCRPCR技术技术 29*in situ PCR 原位原位PCRPCR是在单细胞或组织切片上是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原
17、位对特异的核苷酸序列进行原位PCRPCR扩增扩增,再进行再进行DNADNA分子分子原位杂交原位杂交的技术的技术-细胞内基因的定位。细胞内基因的定位。30*Nucleic Acid Hybridization 核酸分子杂交核酸分子杂交31*核酸分子杂交核酸分子杂交 :是指单链核酸分子是指单链核酸分子(DNADNA或或RNARNA)在特定条件)在特定条件下下,与另一条互补的特异与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过核酸链形成稳定双链的过程。程。主要依据主要依据:碱基互补、碱基互补、变性和复性变性和复性 DNADNA:DNADNA5ATGCCGAT3TACGGC5ATGCG T A3UA C G
18、CAUDNADNA:RNARNA5AUGCUA CGRNARNA:RNARNA3UACGAUGC几种分子间杂交几种分子间杂交SouthernblotNorthernblotdothybridizationFISH:fluorescence in situ hybridizationNucleic Acid Nucleic Acid HybridizationHybridizationSouthern blotting Southern Southern 印迹杂交法印迹杂交法 Southern Southern 法可用于检测特异的法可用于检测特异的DNADNA序列片断序列片断等。等。(其基本过程
19、类似于上述(其基本过程类似于上述SouthernSouthern法)法)提取提取RNARNA样本样本RNARNA变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至转移至膜膜探针(标记探针(标记DNADNA或或RNARNA)与之杂交)与之杂交显影或显色显影或显色检测信检测信号。号。NorthernNorthern法可用于检测组织细胞中法可用于检测组织细胞中总总RNARNA或或mRNAmRNA Northern blotting Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法Mutation scanning technology突变扫描技术突变扫描技术uComplete gene se
20、quencing uSingle-strand conformation analysis uDenaturing gradient gel electrophoresisuHeteroduplex analysisuDenaturing High Performance Liquid Chromatography uDNA chips uGWASScanning technologies aim to find unknown mutations in candidate or known disease genes.36*Complete gene sequencing全基因测序全基因测序
21、 对对已知基因组序列的物种已知基因组序列的物种进行进行不同个不同个体的基因组体的基因组测序,并在此基础上对个体测序,并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。或群体进行差异性分析。37*全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍墨蝶呤还原酶(墨蝶呤还原酶(SPR)38*当当SPRSPR发生变异时,它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质发生变异时,它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质五羟色胺和去甲肾上腺素的细胞途径。多巴胺和五羟色胺都作用五
22、羟色胺和去甲肾上腺素的细胞途径。多巴胺和五羟色胺都作用于使神经细胞互相传递电或化学信号的突触。结果意味着双胞胎不仅于使神经细胞互相传递电或化学信号的突触。结果意味着双胞胎不仅缺乏多巴胺,还缺乏五羟色胺。缺乏多巴胺,还缺乏五羟色胺。基因组测序解密癌症医学之谜基因组测序解密癌症医学之谜基因组测序解密癌症医学之谜基因组测序解密癌症医学之谜基因组基因组基因组基因组测序用于测序用于测序用于测序用于抗癌药抗癌药抗癌药抗癌药筛选筛选筛选筛选39*Everolimus依维莫司片依维莫司片mTORC1TSC1NF2*40Everolimus依维莫司片依维莫司片Single Strand Conformation
23、 Polymorphism 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 (SSCP)(SSCP)单链单链DNADNA片段片段在在中性条件下中性条件下形成复杂的空间折叠构象,这形成复杂的空间折叠构象,这种立体结构种立体结构依赖其内部碱基组成依赖其内部碱基组成,当有一个碱基发生改变时,当有一个碱基发生改变时,会影响其空间构象,空间构象有差异的单链会影响其空间构象,空间构象有差异的单链DNADNA分子在聚丙分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。41*Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 (SSCP)
24、(SSCP)正常基因正常基因突变基因突变基因PCRPCR变性变性中性中性PAGEPAGE+/+-/+-/-杂合子杂合子42*ATATGCAGGCHeteroduplex Analysis 异源双链分析异源双链分析 由由突突变变和和野野生生型型D DN NA A形形成成的的异异源源杂杂合合双双链链D DN NA A在在其其错错配配处处会会形形成成一一个个凸凸起起,在在非非变变性性胶胶中中电电泳泳时时,会会产产生生与与相相应应的的同同源源双双链链D DN NA A不不同同的的迁迁移移率率,从从而而使使两两者者被被分分离离开开。43*Denaturing High Performance Liqid
25、 Chromatography DHPLC,DHPLC,变性的高效液相色谱检测变性的高效液相色谱检测44*异源双链异源双链DNADNA与同源双链与同源双链DNADNA的解链特性不同,的解链特性不同,在部分变性条件下在部分变性条件下,异源双链异源双链因有错配区的因有错配区的存在而更易变性,在存在而更易变性,在色谱柱中的保留时间短色谱柱中的保留时间短于同源双链于同源双链,故先被洗脱下来,在色谱图中,故先被洗脱下来,在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。表现为双峰或多峰的洗脱曲线。45*Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)DGGE)变性梯度凝胶电
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