靶向DNA的Ⅱ类CRISP...Cas系统的蛋白工程化改造_梁丽亚.pdf

2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：86-101靶向DNA的类CRISPR/Cas系统的蛋白工程化改造梁丽亚，刘嵘明（大连理工大学生物工程学院，辽宁 大连 116024）摘要：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）protein是细菌或古细菌特有的一种获得性免疫系统，自从研究人员将其改造为基因编辑工具之后，CRISPR/Cas系统高效的基因编辑能力对生命科学、生物工程、生物医药、食品及农业科学等多个领域引发了革命性的影响。然而，研究者们发现CRISPR/Cas系统存在脱靶效应、PAM位点识别范围有限等问题，限制了CRISPR/Cas的应用。为了解决这些问题，针对Cas蛋白进行工程化改造已经成为了优化及开发CRISPR/Cas系统的重要策略。本文以类CRISPR/Cas系统中靶向DNA的CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cas12a为例，聚焦近年来针对Cas9和Cas12a蛋白的优化改造方法及相关进展进行系统阐述总结，包括Cas蛋白的工程化改造提升基因编辑特异性及改变PAM识别能力，以CRISPR/Cas系统作为基因定位工具开发新功能，结合外源蛋白调控CRISPR/Cas系统功能。这些工作开发了系列高特异性、高精度的CRISPR/Cas系统，极大地扩展了CRISPR/Cas系统的功能及适用范围，为CRISPR/Cas系统的多领域应用做出了重要贡献。关键词：CRISPR；Cas9；Cas12a；Cas 蛋白质工程；基因编辑中图分类号：Q812 文献标志码：A Protein engineering of DNA targeting type CRISPR/Cas systemsLIANG Liya，LIU Rongming（School of Bioengineering，Dalian University of Technology，Dalian 116024，Liaoning，China）Abstract:With different types of nucleases,genome editing technologies have opened up the possibility for targeting and modifying specific gene sequences,which show potential applications in basic and applied aspects of biotechnology research.Zinc-finger nucleases(ZFNs)and transcription activator-like effector nucleases(TALENs)are artificial proteins generated by fusing a specific DNA-binding domain with a restriction enzyme FokI DNA-cleavage domain,which arise from their ability to customize the DNA-binding domain for recognition of targeting sequences and cleaving them by the FokI domain.However,the design and construction of such a system are time consuming,laborious and costly.Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated(Cas)protein is a unique acquired immune system of bacteria or archaea.Since researchers constructed the CRISPR/Cas 收稿日期：2022-07-18 修回日期：2022-09-28基金项目：国家自然科学基金（22278058，22208044）；大连理工大学基本科研业务费（DUT22RC（3）012，DUT22RC（3）013）引用本文：梁丽亚，刘嵘明.靶向DNA的类CRISPR/Cas系统的蛋白工程化改造 J.合成生物学，2023，4（1）：86-101Citation：LIANG Liya，LIU Rongming.Protein engineering of DNA targeting type CRISPR/Cas systems J.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：86-101DOI:10.12211/2096-8280.2022-040特约评述第 4 卷 system for gene editing,its high efficiency has revolutionized a variety of fields such as life sciences,bioengineering,biomedicine,food,and agricultural sciences.However,the CRISPR/Cas system still has some challenges,such as off-target effect and limited PAM site recognition range,which limit its further applications.In order to solve these problems,molecular engineering of Cas proteins has become an important strategy for developing and optimizing CRISPR/Cas systems.In this study,with CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12a selected as representative examples for DNA-targeting Class II CRISPR/Cas systems,we focus on the optimization and modification methods,and progress of Cas9 and Cas12a proteins achieved within recent years,such as Cas protein engineering for improved on-target specificity and expanded PAM scopes,developing new functions using CRISPR/Cas systems as gene targeting tools,and introducing exogenous protein domains to regulate CRISPR/Cas functions.These studies have generated a series of high-specificity and high-precision CRISPR/Cas systems,which have greatly expanded their functions and scopes,and made important contributions to the wide-range applications of CRISPR/Cas systems.Keywords:CRISPR;Cas9;Cas12a;Cas protein engineering;gene editing开发精确、高效、通用的基因信息定制及操作技术是生物科学和生物技术的重要目标。以核酸酶为基础的基因编辑技术是一种新兴的能够精确地对生物体基因组靶向位点进行修饰的基因工程技术，与传统的基于同源重组的基因编辑工具相比，基因靶向率提高上万倍。基因编辑核酸酶主要分为4类：巨型核酸酶（meganuclease）1、锌指核酸酶（ZFNs）2、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）3、成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文 重 复（CRISPR）和相关蛋白（Cas）4。其中，巨型核酸酶只能靶向识别特定的DNA序列（可达1240 bp），但特定序列限制了巨型核酸酶的靶向范围5。ZFNs和TALEN都是由DNA结合结构域和DNA切割结构域两部分组成6，通过模块化设计组装087合成生物学 第 4 卷DNA结合结构域，可以定制化对靶向位点进行识别、剪切，但是这两种工具的制备成本较高，合成时间相对较长6。与基于蛋白结合特定DNA序列的核酸酶 ZFNs、TALEN 相比，CRISPR/Cas 系统使用短RNA序列作为特异性识别元件，不仅具备了设计简单、成本低廉、靶向范围广等优势，在微生物、植物、动物（包括人体）等生物体内也表现出了较高的通用性6。正是基于这种独特的功能机制，CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代的基因编辑工具，目前被广泛应用于基因编辑7-8、基因转录调控9-11、碱基编辑12-13、基因成像14-15和表观遗传16-17等领域。由于 CRISPR/Cas系统对生物科学和生物技术发展的推动作用，2020 年度的诺贝尔化学奖颁发给了基于 CRISPR/Cas系统的基因编辑工具发明人Jennifer A.Doudna教授和Emmanuelle Charpentier教授。在过去几年中，科研人员对CRISPR/Cas系统进行了深入的研究。在细菌和古细菌中发现了许多新的CRISPR/Cas系统，这些系统中Cas蛋白的结构和功能正在被阐明。CRISPR/Cas系统分为类和类，类系统代表 CRISPR-Cas 基因座的约90%，并且存在于不同的细菌和古菌门中。但是，由于类 CRISPR/Cas 系统是多蛋白复合体，由47个Cas蛋白亚基组成，因此不利于在不同宿主中进行高精度基因编辑。类CRISPR/Cas系统是多功能域组成的单蛋白，与类系统相比，类CRISPR/Cas 系 统 更 易 于 改 造。此 外，类CRISPR/Cas 系统能够通过 DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）的方式切割核酸序列。因此，基于类CRISPR/Cas系统的基因编辑工 具 开 发 更 为 广 泛，包 括 Cas9、Cas12a/b/c、Cas13a/b/c、Cas 及 Cas12k 等18-21。其 中 类CRISPR/Cas 系统中靶向 DNA 的代表性核酸酶是Cas9 和 Cas12a，它们都是由 nuclease（NUC）和recognition（REC）lobes组成的两叶结构（图1）。其中与 PAM 位点识别相关的结构域（PI、WED等）主要位于NUC lobe，与基因编辑特异性相关的结构域（REC3等）主要位于REC lobe（图1）。这两种核酸酶皆可作为单个Cas蛋白起到DNA识别、结合和切割的作用，通过合理设计或定向进化产生的Cas蛋白变体可以进一步提高Cas蛋白的高保真性能22-23。此外，Cas蛋白的蛋白质工程通常被用来改善CRISPR作为一种基因定位的工具。根据对Cas9及Cas12a核酸酶结构上的认知，通过对Cas蛋白关键位点进行定点突变，使Cas蛋白失去 DNA 剪切能力，而失活的 Cas 蛋白（dCas9 和dCas12a）仍然能够靶向结合目标位点，如果融合其他功能结构域，可扩展 CRISPR/Cas 系统的功能9-11，24-25。而这些针对 Cas 蛋白的设计与改造，主要是以Cas9和Cas12a蛋白为目标进行研究，使研究者们对这些Cas蛋白的结构（图1）以及作用机制有了进一步的了解27-30。本文聚焦近年来针对类靶向DNA的Cas蛋白（Cas9和Cas12a）的优化改造方法及相关进展进行系统的阐述总结，包括：Cas蛋白的工程化改造提升基因编辑特异性及改变PAM识别能力；以CRISPR/Cas系统作为基因定位工具开发新功能；结合外源蛋白调控CRISPR/Cas系统功能。这些研究工作显著提升了对Cas蛋白结构及功能上的认知，提高了CRISPR/Cas系统的效率并扩展了其应用范围。1 工程化改造Cas蛋白实现高精度基因编辑1.1 Cas蛋白工程化改造提高基因编辑特异性高精度的基因编辑是实现CRISPR/Cas系统广泛应用的前提，尤其是针对基因治疗方向的应用，高精度的基因编辑是从实验室走向临床的必要前提。然而，CRISPR/Cas系统在基因编辑时有一定概率会与非靶点DNA序列错配结合，引起非预期的基因突变，即脱靶效应（off-target），从而造成不可预测的风险。因此，通过工程化改造Cas蛋白以提高靶向特异性成为了研究热点之一。这部分的研究工作可根据研究方法的不同，大体上分为两种方式。第一种是基于Cas蛋白的晶体结构的理性或半理性设计及改造方法（表1）。基于Cas9或Cas12a蛋白的晶体结构，挖掘其与靶向及非靶向DNA相互作用的位点，使用丙氨酸扫描（alanine scanning）、饱和突变等方法进行定点突变，结合on-target及off-target效率检测，进088第 4 卷 图图1Streptococcus pyogenes Cas9与crRNA和靶DNA复合物的晶体结构（PDB：4OO8）和Acidaminococcus sp.Cas12a与crRNA和靶DNA复合物的晶体结构（PDB：5B43）26Fig.1Crystal structures of the complexes of Streptococcus pyogenes Cas9(PDB:4OO8)and Acidaminococcus sp.Cas12a(PDB:5B43)with guide RNA and target DNA 26089合成生物学 第 4 卷而筛选出高特异性 Cas蛋白。研究人员通过分析Cas蛋白的晶体结构发现gRNA识别与REC结构域和WED结构域存在直接关系26-29，因此，涉及上述结构域的定向改造较多。以 SpCas9 蛋白为例，J.Keith Joung 团队通过研究 SpCas9-sgRNA-target DNA复合体空间结构，针对Cas蛋白与DNA直接作用的REC结构域的关键位点，利用丙氨酸扫描的方法，构建了高特异性核酸酶变体SpCas9-HF1（N497A/R661A/Q695A/Q926A），在 保 持 了 高 于70%的 on-target 效率的同时，使用基因组层面的off-target扫描方法（GUIDE-seq）并未发现明显的off-target现象31。Tan Yuanyan等针对SaCas9蛋白与靶向 DNA 相互作用的氨基酸残基进行定点突变，进而提高SaCas9基因编辑特异性，结果表明SaCas9-HF 在测试的 15 个位点中，9 个位点无脱靶，6 个 位 点 脱 靶 率 明 显 降 低36。通 过 分 析SpCas9蛋白的晶体结构，发现在NUC叶中有一个带正电的凹槽（nt-groove），这个区域相关的蛋白结构域与非靶向DNA链存在相互作用32。而非靶向链会间接影响SpCas9-sgRNA-target DNA复合体的稳定性，因此，nt-groove周边的蛋白结构域也会影响基因编辑的特异性32。2016 年，Zhang Feng团队32通过分析 SpCas9的蛋白结构，对 nt-groove 区 域 中 的 31 种 氨 基 酸 进 行 了 Alanine Scanning 突变，并将其中的多个有效突变进行组合，获得了eSpCas9（1.0）SpCas9（K810A/K1003A/R1060A）和 eSpCas9（1.1）SpCas9（K848A/K1003A/R1060A）。其中，eSpCas9（1.1）与野生型SpCas9在绝大多数靶向位点的基因编辑效率相当，同 时 off-target 的 效 率 明 显 降 低。之 后，Jennifer A.Doudna 团队33在分析 SpCas9-HF1 和 eSpCas9（1.1）靶向位点后，在REC3区域设计突变 并 构 建 了 HypaCas9（N692A/M694A/Q695A/H698A），并利用 GUIDE-seq 方法将 HypaCas9 与SpCas9-HF1 和 eSpCas9（1.1）比较，结果表明这三者的基因编辑的特异性相当。2022年，Liu Jin团队35根据DNA剪切时的Cas9蛋白结构，靶向Cas9蛋白多个结构域，设计了10个含组合突变的Cas9变体，最终筛选获得的Cas9变体hscCas9-v1.2（HSC1.2）可明显降低 off-target。同年，David W.Taylor团队34根据冷冻电镜解析SpCas9蛋白的结构，突变了RuvC结构域与spacer上1820碱基错配相关的7个氨基酸，获得的SuperFi-Cas9与原始SpCas9 相比，可在保证编辑效率不变的情况下，on-target/off-target的振幅比提高了4.06倍。第二类方法是针对大肠杆菌37-40和酵母菌22这些模式菌株构建高效的筛选方法，可以对特定结构域进行饱和突变或整个蛋白随机突变进行快速筛选，将产生 off-target 的突变体分离或去除，从而获得高编辑效率、高特异性的 Cas蛋白突变体（表2）。Antonio Casini 等22构 建 了 酵 母 报 告 菌 株（yeast reporter strain），其原理是在酵母菌基因组的TRP1和ADE2基因上构建了on-target和off-target靶表表1基于蛋白结构的理性或半理性设计提高Cas蛋白特异性Table 1Engineering Cas proteins for improved on-target specificity using rational/semi-rational design based on protein crystal structures名称SpCas9-HF1eSpCas9(1.1)HypaCas9SuperFi-Cas9hscCas9-v1.2SaCas9-HFenAsCas12a-HF1突变N497A/R661A/Q695A/Q926AK848A/K1003A/R1060AN692A/M694A/Q695A/H698AY1010D/Y1013D/Y1016D/V1018D/R1019D/Q1027D/K1031DN14A/R765A/R447A/S845DR245A/N413A/N419A/R654AN282A改造的结构域REC3,RuvC3HNH,RuvC3(nt-groove)REC3RuvCREC1,RuvC,HNHREC,RuvC3REC1PAMNGGNGGNGGNGGNGGNNGRRTTTYN,VTTV,TRTV精度最高提升倍数1919194.061.6721.89参考文献3132-333334353623enAsCas12a also contains the E174R/S542R/K548R mutations，which can expand PAM compatibilitythe improvement of the ratio of amplitudes for on-target and off-target product formed using SperFi-Cas9 and SpCas9.090第 4 卷 向位点，在对Cas9蛋白的REC3区域进行了随机突变之后，使用Cas蛋白突变体文库对酵母菌基因组的TRP1基因进行靶向改造，无编辑能力的Cas9蛋白突变株无法在选择性培养基中存活；TRP1 和ADE2基因都发生基因编辑，菌株显白色，表明突变株存在off-target；仅有TRP1基因发生基因编辑，菌株显红色，表明突变株在保持特异性的基因编辑的同时，并没有脱靶现象的存在，这种Cas9蛋白突变体便是潜在的特异性高的Cas蛋白。通过筛选并进一步组合突变获得的evoCas9蛋白，与原始Cas9蛋白相比，在保持 90%的 on-target效率的同时，基因编辑特异性也提高了79倍。而通过这种文 库 构 建 筛 选 获 得 的 Cas 蛋 白 如 HiFi-Cas9、Sniper-Cas9、Opti-SpCas9、xCas9-3.7等都在REC3结构域及其他结构域存在突变（表2）。与第一类改造方法的结果类似，这些突变会导致Cas蛋白与靶向 DNA 的结合稳定性降低，在靶向序列与gRNA不能完全匹配时，这些突变就不能稳定地与靶向DNA结合，导致Cas蛋白的空间结构仍处在非剪切状态，最终消除 off-target 的现象33，41，45。因此，这些突变并没有改变Cas蛋白与靶向DNA的结合效率及频率，从而保证Cas蛋白在保持较高的 on-target 效率的同时，也能够降低 off-target 的效率。1.2 Cas蛋白工程化改造改变PAM位点识别能力每个天然Cas蛋白的PAM位点是固定的46-47，以 SpCas9 为 例，SpCas9 蛋 白 的 PAM 序 列 是“NGG”，然而不同的生物系统中“NGG”的含量是不同的。在针对一些AT-rich的生物系统以及一些特殊的靶向位点时，除了选用不同Cas蛋白的策略，也可以通过工程化改造 Cas蛋白来改变 PAM位点的识别能力，包括改变PAM位点的碱基组成（表 3）以 及 增 加 或 减 少 PAM 位 点 的 碱 基 数量（表4）。从Cas-gRNA-target DNA的复合体结构中可以发现，PAM序列的识别与PI结构域和WED结构域有着直接关系26。与改造 Cas蛋白的基因编辑特异性类似，针对PAM位点识别能力的改造也是在模式菌株中构建高效的筛选方法，首先针对 PI、WED结构域或者整个Cas蛋白进行随机突变，使用不同PAM位点设计的gRNA筛选识别Cas蛋白突变文库中的正向突变，然后通过组合突变以进一步优化 PAM 位点的识别能力41，44，49，53，61。David R.Liu团队62利用噬菌体辅助连续进化（PACE）的方法鉴定了三种能够识别非 G PAM 序列的新SpCas9蛋白变体。这些SpCas9蛋白的变体能够进一步提高CRISPR/Cas系统的靶向范围，在人类基因组上的靶向位点增加了 1.4 倍。Johnny H.Hu等41使用 PACE 方法构建了 Cas9 蛋白变体文库（XCas9s），通过筛选获得的正向突变不仅可扩展PAM 的识别范围，同时降低了 off-target 的效率。Zhang Feng团队44在大肠杆菌中构建了负向筛选的方法，以含有氨苄青霉素（Amp）抗性质粒为靶向目标，通过饱和突变 AsCas12a 中所有接近PAM的60个氨基酸，使用扩增子测序比较空白对照与AsCas12a变体之间在含有Amp抗性平板上的区表表2基于模式菌株的高效筛选方法提高Cas蛋白特异性Table 2Engineering Cas protein for improved on-target specificity based on efficient selection in model strains名称evoCas9HiFi Cas9xCas9-3.7Sniper-Cas9Opti-SpCas9AsCas12a-K949AM44突变M495V/Y515N/K526E/H698QR691AA262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I/E1219VF539S/M763I/K890NR661A/K1003HK949ATX_Cas12a的REC1结构域替换改造的结构域REC3REC3REC1,REC2,REC3,PIREC3,RuvC2,HNHREC3,RuvC3BHREC1PAMNGGNGGNG,NNG,GAA,GAT and CAANGGNGGTTTVTTTN精度最高提升倍数92.460.298.4750.2324参考文献223941-4237434440 E1219V in xCas9-3.7 is one of the mutations for the expanded PAM compatibility.091合成生物学 第 4 卷别，从而获得潜在的正向突变，并通过组合突变最终 获 得 了 AsCas12a（S542R/K607R）和 AsCas12a（S542R/K548V/N552R）两个突变体，分别可识别TYCV和TATV的PAM位点（表3）。J.Keith Joung团队53-54在大肠杆菌中构建了一种正向筛选系统，以诱导型的毒性基因作为 CRISPR/Cas 系统的靶点，仅有识别新型PAM位点的Cas蛋白变体能够去除毒性基因所在质粒，因此在筛选培养基中存活下来的皆为含有Cas蛋白正向变体的菌株，而筛选 获 得 的 SpCas9 VQR、SpCas9 EQR 及 SpCas9 VRER变体都能够识别新的PAM位点且PAM位点的碱基数目增加（表4）。PI结构域与PAM序列有着直接的相互作用关系，Zhang Feng和Osamu Nureki团队56将St3Cas9和 SpCas9 的 PI 结构域进行互换，含有 St3Cas9 PI结构域的 SpCas9 变体可以识别 St3Cas9 的 PAM 位点（表4）。谢震团队50通过查找SaCas9的同源蛋白，并将SaCas9的PI结构域中的保守关键区域与同源Cas9蛋白的相关保守区域序列进行替换，构建了多个嵌合Cas9变体。而新构建的Cas9变体的PAM 识别范围也发生了改变，与 SaCas9 相比，PAM的识别范围最多提高了16倍（表3）。此外，通过改造与PAM序列直接作用的氨基酸位点也是改变PAM位点识别能力的方法之一，尤其是在减表表3工程化改造Cas蛋白改变PAM位点的碱基组成Table 3Engineering Cas proteins to change the nucleotide sequences of PAM名称SpCas9xCas9-3.7SaCas9SaCas9 KKHv42-wtAsCas12a/LbCas12aAsCas12aAsCas12aLbCas12aLbCas12a突变A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I/E1219VE782K/N968K/R1015HSaCas9 上PI结构域的13个保守氨基酸序列被替换S542R/K607RS542R/K548V/N552RG532R/K595RG532R/K538V/Y542R改造的结构域REC1,REC2,REC3,PIPIPIWED,PIWED,PIWED,PIWED,PIPAM范围变化NGGNG,NNG,GAA,GAT and CAANNGRRTNNNRRTNNVRRNTTTVTYCVTATVTYCVTATV参考文献4841849505144,524444,5244The original PAM is shown for the wild-type Cas9 and Cas12a from each organismR=A/G，V=G/A/C，Y=C/T.表表4工程化改造Cas蛋白增加或减少PAM位点的碱基数量Table 4Engineering Cas proteins to increase or decrease the nucleotide number of PAM名称SpCas9SpCas9 VQRSpCas9 EQRSpCas9 VRERSp-St3Cas9SpCas9-NGSpGSpRYFnCas9RHA FnCas9突变D1135V/R1335Q/T1337RD1135E/R1335Q/T1337RD1135V/G1218R/R1335E/T1337RSpCas9 与St3Cas9的PI结构域替换R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337RD1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337RSpG(A61R/L1111R/A1322R/N1317R/R1333P)E1369R/E1449H/R1556A改造的结构域WED,PIWED,PIWED,PIPIWED,PIWED,PIBH,WED,PIWED,PIPAM范围变化NGGNGANNGCGNGAGNGCGNGGNGNGNGNNRNNGGYG参考文献4853-5553-5453-54565758585960 The original PAM is shown for the wild-type Cas9 and Cas12a.Y=C/T.092第 4 卷 少PAM位点序列长度以及扩展CRISPR/Cas系统靶向范围上有着重要作用26，57-58。SpCas9 的 R1335与NGG PAM中的第三个G直接相互作用，通过构建 SpCas9-NG 突变体，可使 SpCas9-NG 的 PAM 序列变为 NG57（表 4）。与之类似，Hisato Hirano等60通过 FnCas9 蛋白结构发现，R1556 与 NGG PAM中的第三个G是直接相互作用的氨基酸位点，通过构建 RHA FnCas9 突变体（E1369R/E1449H/R1556A），可 使 RHA FnCas9 的 PAM 序 列 变 为YG（表4）。2 以 CRISPR/Cas 系统作为基因定位工具开发新功能2.1 FokI-dCas9实现特异性基因编辑CRISPR/Cas系统具备高效DNA结合及剪切能力，然而脱靶现象的存在限制了CRISPR/Cas系统的进一步应用。为提高基因编辑的特异性以减少脱靶对基因编辑的影响，J.Keith Joung团队45参考ZENs及TALENs结构，将FokI核酸酶与失活的Cas9蛋白（dCas9）结合形成FokI-dCas9（fdCas9），dCas9 与 gRNA 形成的复合体实现基因的定位，FokI 核 酸 酶 实 现 DNA 单 链 剪 切，与 ZENs 及TALENs 类似，DNA 双链断裂（DSB）也需要两个单元的fdCas9才能实现。由于单个fdCas9不具备DSB能力，在特定距离范围内的两个fdCas9单元同时发生 off-target的可能性较低，因此可实现具有很高特异性的基因编辑。两个fdCas9单元的间隔序列（spacer）之间的距离并非是固定的，这与FokI核酸酶和dCas9之间的结合方式密切相关。FokI核酸酶与dCas9蛋白的N端结合会形成具有较高基因编辑效率的fdCas9，与dCas9蛋白的C端结合时则很难具备较高的基因编辑效率45，63。在 N 端以 GGGGS 为融合蛋白接头（linker），spacer的间距可在 1318 bp之间进行设计45。而以XTEN为linker，spacer的间距可在1539 bp之间进行设计64。但是两个fdCas9单元对相邻的gRNA设计65以及单元递送66都提出了更高的要求。到目前为止，对 fdCas9单元的递送主要以mRNA 形 式 进 行，并 未 发 现 以 核 糖 核 蛋 白（ribonucleoprotein，RNP）复合物形式递送实现有效基因编辑的报道，而RNP复合物与mRNA相比，可进一步提高基因编辑的效率7。然而，如果以RNP复合物作为fdCas9的递送形式，这需要对Cas9蛋白进行进一步的改造，比如使用分裂 dCas9（splitting dCas9）67、更小的dCas9（dSaCas9）68等。2.2 CRISPRa和CRISPRi系统CRISPR 激 活（CRISPRa）和 CRISPR 干 扰（CRISPRi）是利用 dCas9 与转录激活因子（如VP64）69-70或阻遏结构域（如 KRAB-MeCP2）71融合，通过这些外源蛋白与靶向基因启动子区域的结合来实现基因的转录上调或下调。除了人体或哺乳类细胞，CRISPRa 和 CRISPRi 也被广泛应用于不同的生物系统中。Zhao Huimin 团队72利用酵母的抑制蛋白 RD2、RD5 和 RD11 构建的CRISPRi系统，抑制番茄红素代谢途径中ERG9和MNN9 基因转录，明显提高了番茄红素的产量。Dong Chen 等11使用大肠杆菌的转录激活因子SoxS_R93A构建的 CRISPRa对外源乙醇合成途径进行调控，实现了乙醇的富集。此外，在蓝藻73和放线菌74中也成功实现了基于CRISPR系统的基因转录调节。由于 CRISPRa 和 CRISPRi 系统的唯一可变单元是在gRNA上的spacer系列，因此，可以设计并合成gRNA文库从而扩展至基因组层面进行高通量的转录调控。邢新会团队10在大肠杆菌中构建了全基因组范围的sgRNA文库，结合CRISPRi技术在大肠杆菌全基因组范围内筛选糠醛和异丁醇耐受性基因位点，为菌株的进一步工程化改造提供了研究基础。Alex Marson 团队利用 CRISPRa 和CRISPRi技术对人类T细胞中的近2万个基因进行了筛选，发现了上百个对细胞因子起到调节作用的基因，为T细胞以及CAR-T细胞功能调节提供了靶向基础75。2.3 基于CRISPR/Cas系统的碱基编辑器和先导编辑CRISPR/Cas 系统能够切割基因组形成 DSB。然而，在使用过程中发现由于 DSB 会导致基因093合成生物学 第 4 卷组出现 DNA 片段的缺失、易位等基因序列的大幅度改变。为此，David R.Liu 团队76开发了胞嘧啶碱基编辑器（cytosinebase editor，CBE），以CRISPR/Cas系统进行基因定位，但不依赖DSB的方式将 CG 修改为 TA，同时不引起 DNA 片段的缺失、易位。在第一代至第三代碱基编辑器（BE1，BE2，BE3）进化过程中，与胞苷脱氨酶（cytidine deaminase）相连的dCas9转变成了nCas9（nickase Cas9，D10A），同时在Cas蛋白的C端融合UGI（uracil DNA glycosylase inhibitor），防止修改产生的U被宿主碱基错配修复，进一步提高了编辑效率76。之后，David R.Liu 团队77对 BE3 linker蛋白以及UGI数量进行了优化，得到的BE4具有更高的编辑效率，且indel的概率进一步降低。在构建更高效的 CBE 的过程中，David R.Liu 团队24又开发了腺嘌呤碱基编辑器（adenosinebase editor，ABE），可以将TA修改为CG，这对于大部分单碱基遗传病的基因治疗提供了潜在工具。与CBE不同，ABE不需要UGI来干扰宿主碱基错配，而 ABE的迭代进化主要集中在与 nCas9相连的TadA蛋白，利用抗生素筛选方法对ABE进行了连续七轮进化，最终获得的 ABE7.10碱基编辑效率可达50%24。2020年张学礼和毕昌昊团队78合作开发C-to-A、C-to-G碱基颠换的单碱基编辑工具（CGBE）。之后，David R.Liu、Britt Adamson 及Jonathan S.Weissman 团 队79合 作 利 用 高 通 量CRISPRi筛选，识别影响C-to-G编辑效率的基因并开发多个新的CGBEs，在此基础上，使用深度学习的方法开发了 CGBE-Hive 模型，可成功预测CGBE编辑效率。David R.Liu团队80基于 nCas9（H84