PCV2_Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备_李钰昌.pdf

黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷收稿日期：2022-05-17基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019C046）。作者简介：李钰昌（1997-），男，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2019 级硕士研究生。通信作者：曹宏伟，女，教授，博士研究生导师，Email：；肖莉杰，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：。PCV2 Cap 蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备李钰昌1，郑亮1，2，张华1，2，3，吴志军1，2，3，肖莉杰1，2，3，曹宏伟1，2，3（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院；3.黑龙江八一农垦大学生物技术中心）摘要：猪圆环病毒 2 型是一种常见的猪感染性病毒，Cap 蛋白为猪圆环病毒 2 型的核衣壳蛋白，也是该病毒最主要的结构蛋白，是目前猪圆环病毒 2 型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了 Cap 蛋白原核表达质粒 pET28a-His-Cap，转化Transetta（DE3）表达菌株，IPTG 诱导表达，经 SDS-PAGE 及蛋白免疫印迹试验验证，重组蛋白主要以可溶性形式表达，少数为包涵体蛋白。以 Ni-NTA 树脂进行蛋白纯化，纯化后蛋白浓度为 629 g mL-1，采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩，浓缩后蛋白终浓度为 1.8 mg mL-1。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化后制备抗原，免疫兔子采集全血，分离血清。经蛋白免疫印迹试验，该多抗与重组蛋白存在免疫反应性，ELISA 检测抗体效价可达 132 000，IFA 试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒 2 型。Cap 蛋白多克隆抗体的成功制备，为后续猪圆环病毒 2 型基因工程疫苗制备过程中验证 Cap 体外蛋白表达提供了材料。关键词：PCV2 Cap 蛋白；原核表达；多克隆抗体中图分类号：S828；S852.65+1文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0078-06Prokaryotic Expression and Purification of PCV2 Cap Protein and Preparation ofPolyclonal AntibodyLi Yuchang1，Zheng Liang1，2，Zhang Hua1，2，3，Wu Zhijun1，2，3，Xiao Lijie1，2，3，Cao Hongwei1，2，3（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.Biotechnology Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University）Abstract：Porcine circovirus type 2 was a common porcine infectious virus.The Cap protein was the nucleocapsid protein of porcinecircovirus type 2，and also the most important structural protein of the virus.It was currently the genetic engineering of porcinecircovirus type 2 key protein for vaccine development.The Cap protein prokaryotic expression plasmid pET28a-His-Cap wasconstructed，transformed into Transetta（DE3）expression strains，and induced by IPTG.It was verified by SDS-PAGE and Westernblot experiments that the recombinant protein was mainly expressed in a soluble form，with a few inclusion bodies.protein.The proteinwas purified with Ni-NTA resin，and the purified protein concentration was 629 g mL-1.The recombinant protein was concentratedby dialysis bag concentration，and the final concentration of the concentrated protein was 1.8 mg mL-1.The recombinant protein wasmixed with Freunds adjuvant in equal volumes，and the antigen was prepared after fLl emLsification.The rabbits were immunizedto collect whole blood and separate the serum.Western blotting test showed that the polyclonal antibody was immunoreactive with therecombinant protein.The antibody titer detected by ELISA could reach 132 000.The IFA test proved that the polyclonal antibody canspecifically recognize porcine circovirus type 2.The successful preparation of Cap protein polyclonal antibody provided material forthe verification of Cap protein expression in vitro during the subsequent preparation of porcine circovirus type 2 geneticallyengineered vaccine.Key words：PCV2 Cap protein；protein expression and purification；polyclonal antibodydoi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.013第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：7883Feb.2023第 1 期猪圆环病毒（PCV）单链环状 DNA 病毒，大小约1.76 kb1，病毒粒子为正二十面体对称，是现有哺乳动物易感病毒中最小的一种2-3。根据血清型的不同，PCV 可以分为四种：PCV1（猪圆环病毒 I 型）、PCV2（猪圆环病毒型）、PCV3（猪圆环病毒 III 型）、PCV4（猪圆环病毒 IV 型）。其中，PCV1 无致病性，PCV3 的致病性尚未明确，PCV4 是于 2019 年在中国湖南省发现的一种新型圆环病毒，可感染各年龄段的猪，感染后临床症状有繁殖障碍，母猪流产、产死胎和腹泻，呼吸系统和神经系统病症等5。PCV2 感染后会导致宿主猪患有 PCVD（猪圆环病毒病）4，该病威胁着全球养猪业，是当今在国际上倍受关注的动物疫病之一6。PCV2 发现于 1998 年，是一种新兴的猪病原体7-8，与 PCV2 相关的疾病被称为 PMWS（断奶仔猪多系统衰弱综合征）。除了 PMWS 之外，PCV2 还与 PDNS（猪皮炎肾病综合征）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、CT（新生仔猪先天震颤）等疾病密切相关9-12，这些疾病命名为猪圆环病毒病（PCVD）13-14。PCV2 基因组包含十一个 ORFs，病毒基因组正链包括 ORF1、ORF5、ORF7 和 ORF10，负链则包括 ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11。在病毒 11 个开放阅读框中，ORF1 及 ORF2 是目前研究最为深入的重要阅读框。ORF1 的编码产物为 Rep 蛋白及 Rep 蛋白，两种蛋白作为复制酶蛋白，它们均在病毒复制过程中发挥重要作用，Rep 和 Rep蛋白都具有与典型滚环复制（RCR）相关的 3 个保守基序，一旦它们的结构发生变化，则病毒的复制过程也会随之发生一系列变化15。ORF2 编码产物为 Cap 蛋白，作为其核衣壳蛋白，其与 PCV2 免疫原性密切相关16，也是最主要的结构蛋白，倍受研究人员关注。研究表明，ORF3 基因的编码产物，在诱导细胞凋亡方面发挥关键作用17；ORF4 基因大小为 180 bp，有报道称，其所表达的蛋白，与 Caspase 的活性及 PK15 细胞的凋亡相关。ORF1、ORF6、ORF7、ORF8 基因编码产物在病毒复制过程中发挥作用，ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF11 等基因编码产物则与病毒入侵机体后提高病毒的致病力有关18-19。PCV2 Cap 蛋白是一种高度保守的蛋白，经研究人员比对发现，在不同的病毒分离株中，其氨基酸同源性高达 99%20。PCV 的类型特异性可能是由各自的 Cap 蛋白决定，由此也可以见得，Cap 蛋白在猪圆环病毒中扮演的角色是至关重要的。同时，Cap 蛋白也是研制 PCV2 基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原21。利用杆状病毒表达系统，以表达 Cap 蛋白病毒感染昆虫细胞，结果发现在病毒感染后期，Cap 蛋白在被感染的昆虫细胞中能够形成病毒衣壳状颗粒22，这一现象可以间接证明 Cap 蛋白为 PCV2 一种主要的结构蛋白。试验进行了 Cap 蛋白原核表达载体的构建，重组蛋白进行表达纯化以及抗原制备等试验，免疫北京大耳白兔，成功制备了兔抗型猪圆环病毒 Cap蛋白的多克隆抗体，为 PCV2 疫苗研发过程中相关病原学检测提供了良好的生物学材料。1材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞、质粒、菌种及动物猪肾上皮细胞（PK15）、pET28a（+）载体、pMD18T-Cap 质粒由生物技术中心 509 试验室保存；Transetta（DE3）表达菌株购自北京全式金生物公司；DH5 感受态细胞购自生工生物工程（上海）有限公司；2 月龄北京大耳白兔一只，购自山东本明兔业有限公司。1.1.2 抗体与试剂山羊抗兔辣根酶标记 IgG（ZB-2301）、鼠抗 His单克隆抗体（TA-01）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；FITC 标记的山羊抗兔 IgG 购自碧云天生物技术有限公司（A0562），限制性内切酶（BamH、Xho）购自 NEB 公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自美国 Sigma 公司；质粒小提试剂盒（D6943-02）和胶回收试剂盒（D2500-02）购自 Omega 公司；Ni-NTA 树脂、PEG8000 购自生工生物工程（上海）有限公司。1.2 试验方法1.2.1 目的基因获取及原核表达质粒构建以试验室保存的 pMD18T-Cap 质粒为模板（Genebank ID：MT376362.1），根据 pET28a（+）载体信息及 Cap 基因序列，设计 Cap 基因对应的同源重组引物（上游引物：5-GCAAATGGGTCGCGGATCCAAT-GGCATTTTCAACACCC-3；下游引物：5-GGTGGT-GGTGGTGCTCGAGTTACTTAGGGTTAAGTGG-3），经聚合酶链式反应（PCR）获取 Cap 基因目的序列，将pET28a（+）载体经 BamH、Xho双酶切，根据无缝克隆试剂盒操作说明，将 PCR 获取的 Cap 基因片段与 pET28a（+）载体相连接，转化至 DH5 感受态细胞，分别进行 BamH单酶切、BamH、Xho双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳试验，验证原核表达质粒pET28a-His-Cap 构建成功。李钰昌等：PCV2 Cap 蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备79黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷1.2.2 蛋白诱导表达对于双酶切鉴定正确的菌株，提取质粒后转化Transetta（DE3）表达菌，涂板，37 培养 1214 h，次日将培养板取出，挑取大小适中、形态分明的单克隆菌落，向无抗 LB 培养基中加入卡那霉素（终浓度为75 ng mL-1），将沾有菌落的枪头放入其中，放置于 37 恒温震荡培养箱，以 220 rpm min-1的转速过夜摇菌。次日，吸取 1 mL 菌液，加入 1 mL 浓度为 50%的甘油溶液，用于菌种保存，剩余菌液进行质粒提取。经酶切鉴定，接阳性菌于 150 mL 培养基中（比例为 1100），向培养基中加入卡那霉素（终浓度为 75 ng mL-1），放置于 37 震荡培养箱中，以 200 rpm min-1的转速震荡培养 4 h，至菌液 OD 值为 0.8。加入 IPTG（终浓度为 0.1 mM），继续以 200 rpm min-1的转速进行蛋白诱导表达，诱导 4 h 后将菌液取出，分别取诱导前及诱导后样品 80 L。以 4、6 000 rpm min-1条件离心 20 min，弃去上清，向沉淀中加入 30 mL Ni-native缓冲液，混匀后置于冰上，放入超声细胞破碎仪，设置超声功率为 20%，超声破碎 20 min。结束后于4、6 000 rpm 离心 20 min，分别取上清及沉淀样品80 L，加入 20 L 蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴15 min，SDS-PAGE 及考马斯亮蓝染色分析蛋白表达情况，结束后进行蛋白免疫印迹试验进一步验证蛋白表达。1.2.3 蛋白纯化取上述成功诱导表达的蛋白上清液，0.22 m 滤膜过滤除去杂质，采用 Ni-NTA 树脂进行蛋白纯化，在样品上柱之前，先向其中加入 10 个柱体积的 Ni-Native 缓冲液，将柱子清洗干净，之后取一个柱体积（约 5 mL）超声破碎上清液，反复挂柱 5 次，使样品中目的蛋白与柱子充分结合，纯化过程中采用 20、30、40 mM 浓度的咪唑洗去杂蛋白（每个浓度加 5 mL），Elution-buffer 洗脱目的蛋白，期间分别取上柱前、上柱后、洗杂蛋白、洗脱目的蛋白等样品，进行 SDS-PAGE 试验验证蛋白纯化结果。1.2.4 动物免疫试验收集纯化所得的重组 Cap 蛋白，采用截留量为7 KDa 的透析袋，并设置咪唑浓度 200、100、50、0 mM，对重组蛋白进行透析。透析后，在透析袋表面撒上少许 PEG 8000，用于浓缩目的蛋白（浓缩倍数约 5 倍），浓缩后 BCA（bicinchoninic acid）法测得最终 Cap 蛋白浓度为 1 mg mL-1。第一次免疫前，取上述所制备的 Cap 蛋白样品 500 L 至 1 mL 注射器，另外一支注射器吸取 500 L 弗氏完全佐剂，将两支注射器安装于三通，来回推动约 40 min 充分乳化制苗，采用背部皮下两点注射方式免疫北京大耳白兔。于第一次免疫后 12 d，用 1 mL 注射器吸取 500 L 蛋白样品，500 L 弗氏不完全佐剂，按照上述乳化方式制苗。二免后 12 d，同样按照第二次免疫前的方式制备疫苗，进行第三次免疫，三免后 10 d 采集兔全血，分离血清。1.2.5 蛋白免疫印迹试验验证多抗血清免疫反应性以重组 Cap 蛋白进行 SDS-PAGE，结束后湿转至 PVDF 膜，结束后配制封闭液，将膜放入封闭液中（小心操作，不要将膜损坏），置于摇床封闭 2 h，封闭结束后，弃去封闭液，加入适量 PBST 洗膜 3 次，每次洗膜 15 min，将上述分离得到的多抗血清进行稀释后作为一抗（1100 稀释），4 过夜孵育，加入适量PBST 洗膜（3 次，每次 15 min）；以 HRP 标记的山羊抗兔免疫球蛋白为二抗，按 11 500 比例稀释，将PVDF 膜置于其中避光孵育 2 h，结束后 PBST 洗膜 3次，每次洗膜 15 min，结束后将 PVDF 膜放置于凝胶成像系统进行曝光成像，保存并分析结果。1.2.6 ELISA 检测多克隆抗体效价取 30 L 纯化后的重组 Cap 蛋白，用抗体包被稀释液按照 5001 的比例将上述蛋白稀释至 15 mL，使得蛋白最终浓度为 2 g mL-1，加入稀释后的蛋白液 100 L 孔-1，加包被液，将板置于 4 冰箱中，包被过夜，向每孔中加入 200 L PBST 溶液，轻微晃动板子，弃去液体，如此重复上述步骤 3 次，结束后拍干，每孔加入 100 L 5%脱脂乳，37 封闭 1 h。将制备的多抗血清以及对照组阴性血清按照 1500、11 000、12 000、14 000、18 000、116 000、132 000及 164 000 比例进行倍比稀释后，加至 96 孔酶标板中，每孔加 100 L，置于 37 孵育 1 h。孵育结束后，向每孔加入 200 L PBST 溶液，轻微晃动板子，弃去液体，重复上述步骤 3 次，结束后拍干。向每孔中加入山羊抗兔免疫球蛋白（HRP 标记），经 11 500 稀释后每孔加入 100 L，37 孵育 1 h，每孔加入 200 LPBST 溶液，轻微晃动板子，弃去液体，重复 3 次，结束后拍干。每孔加 50 L TMB 底物溶液，室温孵育15 min，加入 2 mol L-1的硫酸溶液，终止显色反应。结束后 10 分钟之内，用酶标仪测定 OD450 nm值，分析结果。1.2.7 结果判定将 96 孔酶标板置于酶标仪 OD450 nm处，进行测定，当多克隆抗体孔的 OD450 nm值与阴性对照孔比值（P/N）2.1 时，结果判定为阳性。1.2.8 IFA 检测多克隆抗体特异性80第 1 期从液氮罐中取出 PK15 细胞，复苏后培养传代，至细胞生长状态良好时，0.25%胰酶消化细胞，均匀铺至 96 孔板，等待细胞生长至密度约 70%，选取第一列 8 个孔为 PCV2 接毒试验组，另外选取一列作为不接毒对照组。将培养板置于 37、5%CO2细胞培养箱内培养 36 h；每孔加入 50 L PBS 溶液轻微晃动板子清洗细胞；从 4 冰箱中取出提前预冷的丙酮溶液，向每孔中加入 50 L，于 4 条件下固定细胞 30 min。取出制备好的多抗血清，PBS 进行 100 倍稀释，稀释后每孔加入 50 L，于 37 条件下孵育1 h。结束后向每孔加入 50 L PBS 溶液，轻柔地晃动板子，重复 3 次，吸弃板中液体。取 FITC 标记的山羊抗兔免疫球蛋白，作为二抗，用 PBS 将二抗按照12 000 的比例稀释，向每孔中加入稀释好的二抗50 L，于 37 条件下避光孵育 1 h，结束后向每孔中加入 50 L PBS 溶液，轻柔地晃动板子，重复洗涤3 次，洗去未结合的二抗。结束后，向每孔中加入DAPI 染液，可将细胞核染为蓝色，将上述处理结束的板子放置于倒置荧光显微镜下，观察荧光分布情况，保存图片分析结果。2结果与分析2.1 目的基因获取及质粒构建结果以 pMD18T-Cap 质粒为模板，聚合酶链式反应扩增缺失核定位信号（NLS）序列的 Cap 基因片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在 620 bp 大小处存在 Cap基因目的条带，将目的基因连接至 pET28a（+）载体，单、双酶切鉴定结果显示质粒构建正确，经测序后比对显示质粒构建成功（图 1）。2.2 Cap 蛋白诱导表达及纯化pET28a-Cap 质粒转化 transetta（DE3）表达菌，经IPTG 诱导，SDS-PAGE 结果显示 Cap 蛋白成功表达，大部分存在于上清中，为可溶性蛋白，小部分为沉淀包涵体蛋白（图 2A），以 His 单克隆抗体（11 000 稀释）进行 Western Blot 结果显示存在 Cap 蛋白目的条带，进一步验证蛋白表达（图 2C）。利用 Ni-NTA 树脂，经过 Cap 蛋白反复挂住、梯度咪唑洗杂蛋白、目的蛋白洗脱等步骤，最终获得纯度 90%以上的 Cap蛋白（图 2B），可用于后续的动物接种试验。李钰昌等：PCV2 Cap 蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备A 为 Cap 目的基因获取结果，B 为质粒酶切鉴定结果，C 为测序比对结果图 1pET28a-Cap 原核表达质粒构建Fig.1Construction of pET28a-Cap prokaryotic expression plasmid81黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷2.3 Cap 蛋白多抗血清 Western Blot 检测最后一次免疫后，将兔子处死，收集全血并分离出血清，稀释后作为一抗，经蛋白免疫印迹试验发现于 26 kDa 大小处出现 Cap 蛋白目的条带，结果说明所制备的多抗血清与 Cap 蛋白存在良好的免疫反应性，初步证明多克隆抗体制备成功（图 3）。2.4 Cap 蛋白多克隆抗体 ELISA 效价测定经酶联免疫吸附试验（ELISA），验证结果显示，试验所制备的兔抗 Cap 蛋白的多克隆抗体效价可达132 000（图 4）。2.5 Cap 蛋白多克隆抗体 IFA 检测以 PCV2 感染 PK15 细胞，以制备的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光试验，结果显示，感染PCV2 组出现绿色荧光，未感染组没有观察到荧光，结果表明制备的 Cap 蛋白多克隆抗体能够特异性识别 PCV2（图 5）。A 是诱导表达前后 SDS-PAGE 结果，B 是纯化后 SDS-PAGE 结果，C 是 Western Blot 验证结果图 2Cap 蛋白诱导表达及纯化Fig.2Cap protein induced expression and purification图 3Cap 蛋白多抗血清的 Western Blot 检测结果Fig.3Western Blot results of Cap protein polyclonal antibody图 4Cap 蛋白多克隆抗体 ELISA 效价测定结果Fig.4ELISA titer determination results ofCap protein polyclonal antibody82第 1 期3讨论猪圆环病毒 2 型与断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning mLtisystemic wasting syndrome，PMWS）密切相关，PCV2 主要侵害机体的免疫系统，能造成免疫抑制，常常与 PRRSV、PPV 等造成混合感染，严重影响猪体的健康及生产性能23。该病给我国及世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失，被世界公认为重要的猪传染病。Cap 蛋白是 PCV2 主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，其能与 PCV2 感染的猪血清产生特异性结合，具有中和活性。有研究表明重组表达的 Cap 蛋白可在体外自组装成 VLP24，具有一定的立体结构，分子量较大（一个 VLP 由 60 个 Cap 单体蛋白组成），而若将其 N 端核定位信号序列截去之后，表达出的 Cap蛋白则主要以单倍体或几倍体的形式存在，空间结构相对简单，分子量也相对较小25，更加有利于蛋白的分泌表达及后续的抗体制备。试验设计了缺失核定位信号的 Cap 基因序列的相应扩增引物，并将该序列连接至 pET28a（+）原核表达载体，诱导表达获得重组 Cap 蛋白，免疫兔子后获得Cap 蛋白兔多抗血清。试验结果显示该诱导表达的Cap 蛋白大部分存在于上清中为可溶性蛋白，后续获得的 Cap 多抗血清敏感性良好。通过 IFA 试验，验证了所制备的 Cap 多抗血清能够与 PCV2 病毒产生特异性免疫反应。研究制备的多克隆抗体可用于后续研究 PCV2 的免疫学特性感染机制及致病机理，既可用于临床检测 PCV2，又可为深入研究 PCV2 的免疫学特性奠定基础。参考文献：1 Fenaux M，Opriessnig T，Halbur P G，et al.Immunogenicityand pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of p-athogenic porcine circovirus type 2（PCV2）and nonpatho-genic PCV1 in weanling pigs J.Journal of Virology，2003，77（20）：11232-11243.2 Bassami M R，Berryman D，Wilcox D，et al.Psittacine beakand feather disease virusnucleotide sequence analysis andits relationship to porcine circovirus，plant circoviruses，a-ndchicken anaemia virus J.Virology，1998，249：452-459.3 Tischer I，Rasch R，Tochtermann，et al.Characterization ofpapovavirus and picomavirus-likeparticles in permanentpig kidney cell lines J.Zentbl Bakteriol Htg A，1974，226：153-167.4 董信田，李玉峰，姜平，等.猪圆环病毒 2 型灭活疫苗的制备与免疫效力研究 J.畜牧兽医学报，2008，39（5）：639-644.5 祝羊，梁海英，曾智勇，等.猪圆环病毒 4 型研究进展 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