RNA转录后代谢时空精密控制技术_刘韧玫.pdf
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1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023,4(1):141-164RNA转录后代谢时空精密控制技术刘韧玫1,2,3,李乐诗1,2,杨小燕1,2,陈显军1,2,杨弋1,2(1 华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心,生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;2 华东理工大学药学院,上海市细胞代谢光遗传学技术前沿科学研究基地,上海 200237;3 华东理工大学生物工程学院,上海 200237)摘要:RNA种类繁多且功能多样,是细胞活动的核心分子之一。RNA代谢调控对于基因和RNA功能研究、细胞生命活动解析以及疾病治疗手段
2、的开发都是至关重要的。为了深入研究RNA时间、空间分布以及功能机制,科学家们一直在追求可以在活细胞内对RNA分子活动进行精密控制的技术,这也是近些年生命科学领域的研究热点之一。目前基于基因编辑、转录调控等可以控制RNA转录生成的技术已较为成熟,但对于RNA转录后代谢的控制技术尚在发展与突破阶段。此前,RNA转录后代谢调控工具是通过调节RNA或基于RNA结合蛋白的RNA效应因子来实现的,但它们的时空分辨率较低,很难对RNA转录后代谢进行定时、定量和定位精密调控。光遗传学凭借其独特的高时空分辨率、非侵入性等优势已经被逐步用于发展活细胞RNA代谢时空精确控制技术。目前,基于核苷酸光化学修饰、遗传编码
3、光响应因子的光遗传学工具已经可实现在转录或转录后水平对RNA多种代谢活动的时空精密控制,包括生成、运输、翻译、降解等。本文将介绍RNA代谢调控系统的研究进展,并聚焦于RNA转录后代谢的光遗传学调控技术,同时对其未来发展前景进行了展望。关键词:光遗传学;RNA代谢;RNA功能;时空精密控制;光控RNA结合蛋白中图分类号:Q816 文献标志码:A Technologies for precise spatiotemporal control of post-transcriptional RNA metabolismLIU Renmei1,2,3,LI Leshi1,2,YANG Xiaoyan1
4、,2,CHEN Xianjun1,2,YANG Yi1,2(1Optogenetics&Synthetic Biology Interdisciplinary Research Center,State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2Shanghai Frontiers Science Center of Optogenetic Techniques for Cell Metabolism,School
5、 of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;3School of Bioengineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)Abstract:RNA exhibits complex dynamics and functions at specific times and locations inside cells,which include 收稿日期:2022
6、-09-13 修回日期:2022-11-18基金项目:国家重点研发计划(2022YFC3400100,2019YFA0904800,2021ZD0202200);国家自然科学基金(32121005,21937004,32150028,91857202,32001026)引用本文:刘韧玫,李乐诗,杨小燕,陈显军,杨弋.RNA转录后代谢时空精密控制技术 J.合成生物学,2023,4(1):141-164Citation:LIU Renmei,LI Leshi,YANG Xiaoyan,CHEN Xianjun,YANG Yi.Technologies for precise spatiotempo
7、ral control of post-transcriptional RNA metabolism J.Synthetic Biology Journal,2023,4(1):141-164DOI:10.12211/2096-8280.2022-050特约评述合成生物学 第 4 卷changes in their expression,degradation,translocation,splicing and other chemical modifications.The precise regulation of RNA metabolism is crucial for the st
8、udies of gene and RNA functions,the analysis of cellular activities,as well as the development of treatments for diseases.In order to deeply understand the temporal and spatial distribution and functional mechanism of RNA,scientists are always pursuing technologies that can precisely control the act
9、ivity of RNA molecules in live cells.There are several gene editing-or transcriptional regulation-based methodologies that can regulate RNA synthesis in live cells.However,technologies for controlling the post-transcriptional metabolic behaviors of RNA are highly desirable,but they are less attained
10、.Traditional methodologies for regulating RNA metabolism,e.g.,regulatory RNA or RNA-binding proteins-based synthetic RNA effectors,suffer from low spatiotemporal resolution,making them difficult to dynamically regulate the post-transcriptional RNA metabolism in real time.Optogenetics has been used f
11、or precise spatiotemporal control of RNA metabolism in live cells due to its unique advantages of high spatiotemporal resolution and non-invasiveness.At present,photochemical modifications of nucleotides and genetically encoded photosensitive factors-based optogenetic tools have been applied for spa
12、tiotemporal control of various RNA metabolism at transcriptional or post-transcriptional levels,including transcription,translocation,translation and degradation.This article introduces recent progress in regulation of RNA metabolism,in particular the optogenetic control of post-transcriptional RNA
13、metabolism,including technologies based on photochemical modified nucleotides,light-induced protein heterodimerization combined with RNA tethering,light-induced interactions between RNA-binding proteins and their cognate RNA motifs.Finally,we highlight prospects on technologies for precise spatiotem
14、poral control of post-transcriptional RNA metabolism.Keywords:optogenetics;RNA metabolism;RNA function;precise spatiotemporal control;light-switchable RNA-binding proteins142第 4 卷 RNA作为DNA与蛋白质之间遗传信息传递的中间载体为人们所熟知。随着基因组学和生物信息学的发展,特别是高通量测序技术的大量应用,科学家发现细胞中还存在种类繁多且数量庞大的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs)1-2。尽管
15、这些ncRNAs不编码蛋白质,但它们在许多重要的细胞生命过程中都扮演至关重要的角色2-4,如在哺乳动物早期发育过程中调节多种基因的正确表达、参与炎症反应等。近年来RNA生物学研究进展迅速,不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、起源、功能与调控已经成为了国际研究前沿,而小 干 扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)、RNA适配体以及基于RNA的基因操作与分子识别技术也是国际生物技术应用的重要热点之一。这些研究不仅革新了人们对许多生物学基本概念和基本问题的认知,而且在生命科学、生物工程和医学中具有广阔的应用前景。细胞内的RNA具有特定的时间、空间分布及不同的转录后修饰状
16、态,可以像蛋白质一样形成复杂的高级结构进而与其他分子产生相互作用5-7。但与蛋白质研究相比,科学家们对细胞内RNA的时间空间分布及其功能研究目前仍然相对滞后很多,其中一个重要原因是过去很长时间里缺乏可以在活细胞内对RNA分子活动进行精密控制的技术,使得深入研究RNA功能与调控机制面临重要技术挑战。迄今为止,RNA调控技术的研究主要集中在RNA 生成的控制,包括在基因和转录两个层面。在基因层面上,科学家们可以利用基因编辑技术,如锌指核酸酶(ZF)、转录激活因子样效应物(TAL 或 TALE)以及成簇的规则间隔的短回文重复序列与其相关蛋白(CRISPR/Cas),通过对特定DNA序列的敲入、敲除、
17、替换或突变等遗传操作,进而实现对RNA序列和功能的改变8-9。在转录水平上,各种基于 Gal4、LexA 等 DNA 结合结构域、TALE或CRISPR/dCas(核酸酶缺陷型Cas 蛋白)的转录调控系统10-13与表观遗传修饰系统13-15也陆续被开发出来,可以实现对活细胞和活体内源与外源RNA生成的时空精确控制。然而,除了RNA的生成,RNA还存在很多的转录后代谢活动。例如,转录生成后的RNA要经历剪接、加帽、聚腺苷酸化等关键过程才能形成成熟的信使 RNA(mRNA)16,成熟的 mRNA 有时还需要进行不同的化学修饰,如 m6A、m6Am、m5C、m1A、假尿苷、A-to-I17,随后才
18、被转运到细胞质中进行蛋白质翻译。除了mRNA以外,转录后非编码RNA也需要被正确折叠、运输到特定的细胞区室以发挥其正常生物学功能,包括参与染色质修饰、转座子沉默、pre-mRNA的剪接、基因沉默与逆转录等过程18-21。因此,这些RNA的转录后代谢活动可以用于调节基因表达产物的丰度、时空分布以及功能,在多种生理和病理过程中均发挥至关重要的作用22-23。综上所述,发展RNA转录后代谢的精密调控技术将极大促进人们从整合生物学的角度全面认识RNA的时空动态变化调控规律。本综述将聚焦于RNA转录后代谢调控技术的研究进展,总结和讨论该领域的前沿技术方法以及展望其未来的发展方向和前景。1 传统非光控 R
19、NA 转录后代谢调控系统此前,科学家们可以通过反式调节因子在转录后水平对 RNA 代谢进行控制18,24,如调节RNA(regulatory RNA)和 RNA 结合蛋白。一方面,随着越来越多类型调节RNA的作用机制被解析,科学家们基于调节RNA发展了系列人工合成的 RNA效应因子,它们一般包含两种作用方式:通过招募内源功能蛋白质或通过与内源RNA结合机制竞争(占位作用)来调节目的RNA的代谢;因本身就携带RNA修饰或其他的RNA调控功能结构域而直接作用于目的RNA。另一方面,科学家们在过去的20多年时间内也确定了大量的RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)以及它
20、们特异性的识别结合序列,并尝试通过将RNA结合蛋白或其RNA结合结构域与不同的功能结构域融合,开发了系列人工合成的RNA效应因子,试图通过操控这些人工合成RNA效应因子的活性或功能来达到调控RNA代谢的目的(表1)。143合成生物学 第 4 卷1.1 基于调节RNA的RNA代谢调控技术在很长一段时间里,调控RNA代谢的方法主要是利用 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术,它是一种进化上保守的序列特异性调控机制,可在转录水平或转录后水平由双链RNA诱发基因沉默。RNAi最早在1995年被Guo等25在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中首次发现,随后陆续在动物、植物和
21、真菌在内的真核生物中发现26,并被发展成为一种能在单细胞或活体内对特定基因功能进行调控与分析的有用工具。在哺乳动物细胞中,人们可以通过体外化学合成、体外转录或体内直接表达微小RNA(microRNA,miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)以及与Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA)等小RNA(small RNAs,sRNAs)图1(a)。sRNAs被装载Ago蛋白后其正义链会被降解,剩下的反义链可介导RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complexes,RISC)靶向到与sRN
22、A序列互补的mRNA或DNA分子,通过降解mRNA分子或抑制mRNA翻译,或者抑制DNA甲基化和染色质修饰来达到沉默特定基因的目的27-30。与 RNAi 技术的原理类似,反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)或长互补gRNA也可被设计为具有特定RNA调控功能的人工合成RNA效应因子,它们通过与目的RNA的结合来招募细胞内源功能蛋白质或通过位阻效应来调控目的RNA的代谢31。例如,通过化学修饰的ASO或gRNA将内源ADAR酶(adenosine deaminase acting on RNA)招募到特定双链 RNA(dsRNA),促使ADAR酶与该RNA
23、结合,通过脱氨基作用将腺苷转化为肌苷使得RNA变得不稳定,从而实现RNA A-to-I编辑32-33图1(b)。此外,人们可以设计治疗性的ASO,它们可以按照碱基互补的方式来识别目的mRNA或pre-mRNA,通过招募RNase H进行RNA降解和翻译的调控,或者通过位阻效应阻断剪接信号来调控RNA的剪接图1(c)34-35。其中,RNase H是一种内源性的核糖核酸内切酶,它能够水解与 DNA 结合的 RNA 链上的磷酸二酯键,而不能水解单链或双链DNA或单独RNA链中的磷酸二酯键,因此能够特异性降解RNA/DNA异源双链体中的RNA分子。此外,RNase H还可以通过空间位阻效应阻止核糖体
24、与RNA的结合而抑制蛋白质翻译。值得一提的是,此前还存在一种通过RNase H非依赖性反义寡核苷酸调控RNA代谢的方法。比较经典的例子是通过磷酸二氨基酯吗啉代低聚物调控3非翻译区被插入了高效锤头状核酶(highly efficient hammerhead ribozymes,HHR)的 目 的mRNA的降解36图1(d)。锤头状核酶是一类具表表1RNA转录后代谢调控系统项目工作原理诱导条件细胞毒性制备方法可调性时间分辨率空间分辨率普适性基于调节RNA的RNA效应因子自带或招募内源功能蛋白或空间位阻效应无低遗传编码或体外合成难低低高基于RNA结合蛋白的RNA效应因子RNA结合蛋白与不同功能结构
25、域融合获得系列人工合成RNA效应因子无低遗传编码难低低高基于光化学修饰的核苷酸DNA/RNA中引入光化学修饰的寡核苷酸,光照调 控 DNA/RNA活性多数为UV光,少量为可见光高体外合成适中适中高低基于光笼蛋白质或其配体利用光可移除的 囚 笼 基 团 对RNA 结合蛋白或其配体活性进行调控UV光高体外合成适中适中高低基于光诱导蛋白异二聚化和RNA结合蛋白光诱导蛋白异二 聚 化 来 调 控RNA 结 合 蛋 白的活性蓝光低遗传编码容易高高未知基于光控RNA结合蛋白PAL的RNA效应因子光诱导的PAL蛋白与 RNA 适配体的结合蓝光低遗传编码容易高高未知基于光控RNA结合蛋白LicV的RNA效应因
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