[医学]15遗传性疾病分子诊断.ppt
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1、分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学第十五章第十五章 遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病的分子诊断 基因工程研究所南方医科大学南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学教学目的与要求教学目的与要求 了解了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷分子诊断的适应症。(包括胚胎植入前)遗传缺陷分子诊断的适应症。熟悉熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。掌握掌握遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临
2、床意义。重点重点遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临床意义。难点难点遗传性疾病的分子机制。遗传性疾病的分子机制。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学本章目录本章目录n第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*n第二节第二节 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断n第三节第三节 产前(包括胚胎植入前)遗传缺产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断陷的分子诊断*南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*
3、n一、直接诊断策略一、直接诊断策略n二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析n三、基因突变的定量(三、基因突变的定量(dosage)诊断)诊断 南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学一、直接诊断策略一、直接诊断策略定义:直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变定义:直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型:点突变类型:点突变 缺失缺失 插入插入 倍增倍增前提:基因已经克隆,序列和结构清楚前提:基因已经克隆,序列和结构清楚南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学(一)点突变的诊断1、基因背景清楚的点突变基因背景清楚的点突变n等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele sp
4、ecific oligonucleotide,ASO)nPCR-ELISAn等位基因特异性扩增(allele specific amplification,ASAnPCR-RFLPn测序n基因芯片技术等进行诊断南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学2、基因背景未知的点突变n单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)n变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)n异源双链分析(heteroduplex analysis,HA)nDNA序列测定n蛋白截短
5、测试(protein truncation test,PTT)南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学(二)片段性突变的检测(1)少数核苷酸缺失或插入 检测点突变的方法(2)大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变,碱基的缺失、插入、扩增和重组。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析检测原理检测原理:多态性连锁分析、关联分析检测前提检测前提:致病基因尚未被定位和阐明基因太大突变种类太多检测方法检测方法:RFLP,VNTR,STR,SNP南方医科大学分子诊断学分子诊断学分
6、子诊断学分子诊断学三、基因突变的定量诊断三、基因突变的定量诊断检测方法检测方法:细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增检测内容检测内容:大范围的重复、缺失南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学方法方法分辨率分辨率(碱基数碱基数)说说明明细细胞分裂中期染色体胞分裂中期染色体检检测测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色;CGH5 x 106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交;FISH5 x 104用修饰(如纤维探针)来增强分辨率;阵阵列列CGH5 x 104使用阵列化的细菌人工染色体载体(Bacterial artificial chromosomes,BACs)
7、而非细胞分裂中期染色体作为探针;MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交,然后再扩增探针;微微卫卫星星PCR1 x 102取决于缺失区已知的微卫星;差异差异PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的质和量,结果为相对量,是一种半定量方法;竞竞争争PCR1 x 102准确,结果为摩尔数,是一种绝对定量方法;Real-time PCR1 x 102成本较高,可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针,应用越来越广泛;长长片段片段 PCR1 x 102检测基因内缺失比重复更有效,可以确定突变的性质。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学第二节第二节 遗传病
8、的分子诊断遗传病的分子诊断n一、血红蛋白病一、血红蛋白病n二、血友病二、血友病n三、肌营养不良症三、肌营养不良症n四、苯丙酮尿症四、苯丙酮尿症n五、囊性纤维化五、囊性纤维化n六、亨廷顿病六、亨廷顿病n七、脆性七、脆性X综合征综合征南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学一、血红蛋白病一、血红蛋白病血血红红蛋蛋白白具具有有4个个亚亚基基组组成成的的四四级级结结构构,每每个个亚亚基基可可结结合合1 1个个血血红红素素并携带并携带1 1分子氧分子氧。Hb亚亚基基之之间间通通过过8对对盐盐键键,使使4个个亚亚基基紧紧密密结结合合而而形形成成亲亲水水的的球球状状蛋白。蛋白。南方医科大学分子诊
9、断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学 珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学11 15.5珠蛋白基因簇:南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学血红蛋白的血红蛋白的类型类型成人成人HbHb :HbHb A A 2 2 2 2 979798%98%HbHb A A2 2 2 2 2 2 2 23 3%胎儿胎儿HbHb:HbHb F F 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2胚胎胚胎HbHb:HbHb Gower Gower 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2 (妊娠妊娠1212周内周
10、内)HbHb Gower Gower 2 2 2 2 HbHb Portland Portland 2 2 2 2 南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学血血 红红 蛋蛋 白白 类类 型型南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学血红蛋白病血红蛋白病hemoglobinopathy n结构异常血红蛋白病结构异常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血;不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变n地中海贫血,地中海贫血,珠蛋白的合成降低或消失南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞n镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞,其携带氧的功能
11、只有正常红细胞的一半,患者常因此缺氧窒息。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断方法分子诊断方法限制性内切酶法(RE)ASOARMS、跨越断裂点的PCR(裂口PCR、gap-PCR)南方医科大学
12、分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学S 肽链肽链A肽链肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法法 (Southern Blot)MstII CC TNA GG GG ANT CC1.15 kb0.2 kb1.35 kbASSA南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学S 肽链肽链A肽链肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT C268 bpASSA175 bp175268 443南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学思考题(作业)n书中239页
13、中关于HbE检测请回答下列问题n(1)HbE的突变碱基改变情况n (2)该突变位于蛋白质的第几个氨基酸n(3)突变位点位于氨基酸哪一个外显子上n(4)写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列(5和3端各5个碱基)n (5)用MnlI酶切后,请列出各种可能的情况n(6)结合所学习的知识,请再写出几种可能用于诊断的方法。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学 2.地中海贫血地中海贫血 n由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。n类型:n地中海贫血,n 地中海贫血,n 地中海贫血,n 地中海贫血,以此类推。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断
14、学地地 中中 海海 贫贫 血血南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学地中海贫血地中海贫血 每每条条1616号号染染色色体体上上有有两两个个GeneGene缺缺失失程程度度不不同同,链链合合成成部部分分或或完完全全受受到到抑抑制制,导导致致不不同同类类型型的地贫。的地贫。n若若一一条条染染色色体体上上缺缺失失一一个个基基因因()为为+地贫地贫,链合成减少。链合成减少。n若若一一条条染染色色体体上上两两个个基基因因均均缺缺失失()为为0 0地贫地贫,链不能合成。链不能合成。南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学临床类型临床类型类类 型型症症 状状正常人正常人静止型静止型
15、+地贫杂合子地贫杂合子无无症状症状轻轻 型型(标准型)(标准型)0 0地贫杂合子地贫杂合子轻度贫血轻度贫血+地贫纯合子地贫纯合子血红蛋白血红蛋白H H病病 0 0地贫和地贫和+地地贫双重杂合子贫双重杂合子溶血性贫血溶血性贫血HbHb Barts Barts胎胎儿水肿综合征儿水肿综合征 0 0地贫纯合子地贫纯合子胎儿水肿胎儿水肿南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学胎胎 儿儿 水水 肿肿 南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学地贫的分子基础地贫的分子基础 n依依基因缺陷程度分为基因缺陷程度分为:1 1GeneGene缺失型(缺失缺失型(缺失1 1个个基因)基因)2 2
16、非非GeneGene缺失型(点突变):无义突变、移码突变、缺失型(点突变):无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等终止密码突变、剪接突变等结果结果 1 1 生成无功能或稳定性降低的生成无功能或稳定性降低的mRNAmRNA 无义突变无义突变 移码突变移码突变 终止密码突变终止密码突变 起始密码突变起始密码突变 2 2 RNARNA加工突变加工突变 3 3 产生不稳定产生不稳定HbHb南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学n地中海贫血的分子机制 南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断方法分子诊断方法 n(1)PCR法 PCR 法已经成为鉴别缺失型 地中海贫
17、血的首选方法。n(2)ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ Sn(3)ASA法 与ARMS 法相类似n(4)SSCP法 非缺失型2 地中海贫血突变n(5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR)法南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学地中海贫血地中海贫血 珠蛋白珠蛋白Gene Gene 突变或缺失突变或缺失珠蛋白链合成速珠蛋白链合成速率下率下 降降溶血性贫血溶血性贫血 0 0 地贫地贫:链完全不能合成链完全不能合成 +地贫地贫:链可部分合成链可部分合成南方医科大学分子诊断学分子诊断学分子诊断学分子诊断学-地中海贫血临床分类地中海贫血临床分类临临 床床 类类 型型基基 因因
18、 型型基基 因因 产产 物物临临 床床 表表 现现重型重型 地贫地贫+/+、0 0/0 0 0 0/0 0、+/0 0 链几乎不能合成链几乎不能合成 链合成相对增加链合成相对增加HbHb F F和和HbHb A A2 2增高增高地中海贫血面容地中海贫血面容溶血性贫血(需溶血性贫血(需输血)输血)轻型轻型 地贫地贫+/A A、0 0/A A0 0/A A能合成适量的能合成适量的 链链贫血不明显或轻贫血不明显或轻度贫血度贫血中间型中间型 地贫地贫+/+链部分合成链部分合成介于重型和轻型介于重型和轻型之间(不需输血)之间(不需输血)遗传性胎儿遗传性胎儿血红蛋白持血红蛋白持续增多症续增多症缺失或突变缺
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- 医学 15 遗传性 疾病 分子 诊断
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