HBsAg弱阳性质控血清基质液的稳定性比较_陆勤.pdf

中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1Comparison of the stability of matrix solution of HBsAgweakly positive quality control serumLU Qin，SU Jinkun，CHEN Jia，LI Xueming，QI Peiyan，MING HongyanGuangzhou International Travel Healthcare Center，Guangzhou，Guangdong 510635，ChinaAbstract：ObjectiveTo select different matrices to prepare hepatitis B surface antigen（HBsAg）indoor qualitycontrol serum for ELISA，and to find a stable matrix solution for the preparation of HBsAg weakly positive qualitycontrol serum.MethodsA serum mixture of negative HBsAg，anti-HIV，anti-HCV and anti-treponemal was collectedas negative serum（HBV-A），four matrices including negative HBV serum（HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb）and negative for anti-HIV，anti-HCV，anti-treponemal were collected as antibody-negative serum（HBV-B），as wellas four matrices，human albumin（HBV-C）and fetal bovine serum（HBV-D）were used.According to 11 000，12 000，14 000，18 000，116 000，1：32 000，1：64 000 diluted HBsAg positive serum，a dilution series of different matriceswere prepared to detect HBsAg by ELISA method.2-4 times of the cut-off value was confirmed as the target S/COvalue.The four matrix dilution series stored at 4C for 1，3，5，7，9，11 d，1 month and 2 months，target S/CO valuecorresponds to the stability of the concentration were compared.The dilution series prepared with three selectedmore stable matrices were observed for 5 weeks at 4 and 6 months at-20，and the corresponding concentrationof target S/CO values was compared，and the stability of the quality control serum prepared with the three selectedmatrices was compared for 15 months at-20.ResultsThe HBsAg dilution series prepared with HBV-A matrixhad poor stability，and the concentration corresponding to the target S/CO value was reduced by 10 after when storedat 4 for 1 week.Dilution series prepared as substrates were placed at 4 for 5 weeks and-20 for 6 months，with stable concentrations corresponding to target S/CO values.The quality control serum prepared by the threeselected matrices was placed at-20 for 15 months，and the stability difference was not significant（P0.05），thestability was good.ConclusionNegative serum was not suitable as matrix for the preparation of HBsAg weaklypositive quality control serum，and antibody-negative serum，human albumin and fetal bovine serum had good stability经验交流HBsAg 弱阳性质控血清基质液的稳定性比较陆勤，苏锦坤，陈嘉，李雪明，綦佩妍，明红艳广州国际旅行卫生保健中心，广东 广州510635摘要：目的选择不同基质配制乙肝表面抗原（HBsAg）室内质控血清用于ELISA试验，寻找配制HBsAg弱阳性质控血清的稳定基质液。方法收集HBsAg、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清混合液作为阴性血清（HBV-A），乙肝五项（HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb）、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清混合液作为抗体阴性血清（HBV-B），以及人血白蛋白（HBV-C）、胎牛血清（HBV-D）共4种基质，按11 000、12 000、14 000、18 000、116 000、132 000、164 000倍比稀释HBsAg阳性血清，配制成不同基质的稀释系列，用ELISA方法检测HB-sAg，选取临界值的24倍作为目标S/CO值，比较4种基质稀释系列在4下放置1、3、5、7、9、11 d、1个月和2个月，目标S/CO值对应浓度的稳定性。观察3种选定较稳定基质配制的稀释系列，4下放置5周和-20下放置6个月，目标S/CO值对应浓度的变化，比较3种选定基质配制的质控血清在-20下放置15个月的稳定性。结果HBV-A为基质配制的HBsAg稀释系列稳定性不佳，4保存1周，目标S/CO值对应浓度降低10倍。HBV-B、HBV-C和HBV-D作为基质配制的稀释系列，4放置5周和-20放置6个月，目标S/CO值对应的浓度稳定。3种选定基质配制的质控血清-20放置15个月，稳定性差异不显著（P0.05），稳定性良好。结论阴性血清不适合作为配制HBsAg弱阳性质控血清基质，抗体阴性血清、人血白蛋白和胎牛血清稳定性良好，可作为基质使用。关键词：乙肝表面抗原；室内质控；基质液中图分类号：R446.61文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.2023.01.013通信作者：陆勤，E-mail：57中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1室内质量控制是实验室质量体系的重要组成部分，是监测和评价检验工作质量的重要手段。酶联免疫吸附试验（ELISA）中，实验室一般通过增加弱阳性质控品鉴别诊断试剂的质量和控制操作误差，防止弱阳性样品漏检，提高检测准确度1-2。很多实验室购买有证书的商品化弱阳性质控品，其最大的优点是可溯源3，但使用商品化标准物质时，因所用ELISA试剂的灵敏度、临界值不同，不能完全满足检测值在临界OD值24倍的要求而需再次稀释4，且购买质控品增加了检测成本。本实验室尝试用阴性基质液稀释HBsAg阳性血清方法配制HBsAg弱阳性质控血清，并比较了不同基质液配制质控血清的稳定性，现介绍如下。1材料与方法1.1试剂乙肝表面抗原（HBsAg）ELISA检测试剂盒为上海科华生物药业股份有限公司产品（批号：202009231），HBsAg标准物质为北京康彻思坦生物有限公司产品（批号：202006003）。1.2基质液成分1.2.1阳性血清本实验室保存的HBsAg阳性血清，ELISA检测OD3.0。1.2.2基质液有4种：（1）阴性血清（HBV-A），为HBsAg、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体检测均为阴性的血清，（2）抗体阴性血清（HBV-B），为乙肝五项（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清，（3）HBV-C，为人血白蛋白，（4）HBV-D，为胎牛血清。1.3方法1.3.1系列基质液的配制将阳性血清和4种阴性血清56灭活60 min，分别用4种基质液（HBV-A、HBV-B、HBV-C和HBV-D）稀释阳性血清，配制成1500的基质液母液，再12、14、18、116、132、164、1128稀释成11000、12000、14000、18000、116000、132 000、164 000的HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-D稀释系列。4保存。1.3.2筛选基质液稳定性的比较分别在4种系列基质液配制后的第1、3、5、7、9、11 d，1个月、2个月时，用ELISA检测4种基质液的S/CO值，选取S/CO=24作为目标S/CO值，观察不同时间不同系列基质液中目标S/CO值对应的浓度变化趋势，确定不同基质液配制质控血清的稳定性。1.3.3选定基质液稳定性的比较用HBV-B、HBV-C和HBV-D共3种基质液将HBsAg阳性血清稀释成1：500、11 000、12 000、14 000、18 000、116 000、132 000、164 000不同稀释系列。一组保存于4，每周检测1次，共检测5周；另一组保存于-20，每月复溶后检测1次，连续检测6个月。观察保存在不同温度下基质液的目标S/CO值对应浓度的稳定性变化。1.3.4质控血清的配制、分装与保存选取稀释系列中ELISA检测S/CO=24对应的稀释度作为配制浓度，配制1年用量（约50 ml），分装成0.5 ml/支，置-20长期储存。抗体阴性血清配制的质控血清用0.22 m滤菌器过滤后分装，无需加防腐剂。人血白蛋白、胎牛血清配制的质控血清直接分装。1.3.5稳定性试验采用倒计时方式，将检测日期定为第0 d，假如预定在某一温度下保存时间为Nd，在0 d前的第Nd从-70冰箱中抽取10支质控血清置于-20，至0 d统一用ELISA检测，测定反应S/CO值，计算其（平均值标准差）（xs）、变异系数（CV）和P值。采用t检验比较第0 d检测值与3、6、9、12、15月检测值是否存在显著性差异。2结果2.14 种备选基质液的稳定性比较采用4种基质液（HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-D）稀释HBsAg阳性血清，HBV-C和HBV-D稳定较好，4放置2个月时ELISA检测的目标S/CO值对应的稀释度分别保持在116 000和18 000不变。HBV-A配制的HBsAg阳性血清稀释系列在配制后第3d的目标S/CO值对应稀释度由18 000提高到11 000，第5 d提高到1500，随着放置时间增加HBsAg浓度变化较大，放弃使用。HBV-B作基质液时，第3 d目标S/CO值对应稀释度由18 000提高到14 000，2个月时提高到12 000，HBsAg浓度虽然有变化，但进一步优化抗体阴性血清筛查条件，将收集血清HBsAb检测标准控制到S/CO0.05，无显著性差异，表示各组质控血清稳定性良好。见表2。表14和-20下放置不同时间不同基质液配制HBsAg稀释系列的S/CO值Tab.1S/CO values of HBsAg dilution series prepared by different matrix solutions placed at 4 and-20 for different times基质液（1）Matrix solution（1）4-201周2周3周4周5周1个月2个月3个月4个月5个月6个月HBV-B50035.4829.5331.0917.6619.9631.3432.2933.3233.9030.1729.471 00033.9025.8630.4218.9917.2920.9723.2324.5424.4222.2120.272 00024.4223.4526.3014.6212.2411.1512.6812.9413.4112.9311.084 00013.4110.5413.019.077.346.176.496.545.996.265.328 0003.992.294.704.354.262.883.143.052.703.162.3316 0002.071.601.351.322.371.611.451.451.231.590.7632 0001.230.130.170.881.600.470.570.340.450.660.2464 0000.450.010.020.610.700.210.140.110.090.190.07HBV-C50033.7731.2531.5627.8930.2533.5329.8833.7629.8732.9931.231 00033.5827.6230.5520.9222.6832.5932.1633.0622.7431.9728.212 00022.7410.7829.3519.0718.9925.6126.1823.3619.7525.4516.334 00010.759.6019.1013.5514.6215.0814.9211.9210.0615.538.548 0007.064.479.638.055.258.867.216.436.367.555.411 60003.362.053.894.402.823.803.572.972.074.123.113 20001.610.281.501.151.861.921.611.301.062.000.516 40001.060.070.350.650.630.961.140.480.620.970.07HBV-D50031.2232.5431.1732.1531.3931.9833.1632.2531.3729.4425.461 00024.1924.1920.7424.4924.2223.9025.7424.1324.0918.3417.502 00013.9314.9312.1813.5913.4612.8615.5414.3613.4810.698.024 0007.016.916.456.097.817.088.429.237.075.286.978 0003.593.814.662.703.543.644.174.293.602.603.6916 0001.651.381.420.751.171.842.062.231.491.252.8732 0000.760.760.020.010.280.991.070.770.580.551.6664 0000.260.220.010.080.050.510.290.140.170.180.86表2-20保存HBsAg质控血清稳定性（S/CO值）Tab.2Stability of HBsAg quality control serum placed at-20（S/CO value）基质液（1）Matrix solution（1）参数Parameters0月0 month3个月3 months6个月6 months9个月9 months12个月12 months15个月15 monthsHBV-Bxs3.640.203.470.333.430.253.440.293.550.283.480.22CV（%）5.559.57.378.567.776.41P值0.1900.0620.0930.4160.105HBV-Cxs3.280.243.170.273.340.203.430.313.510.293.500.29CV（%）7.358.615.898.918.418.33P值0.3740.5560.2350.0710.075HBV-Dxs3.490.273.430.333.590.283.460.303.410.273.360.31CV（%）7.829.357.888.817.819.26P值0.9770.4140.8070.5310.35659中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1可作为配制质控品的基质。阴性血清不推荐作为配制HBsAg质控品的稀释液。一般认为，人血清基质是理想的质控血清稀释液4，可保证与检测样本反应环境的一致性。但由于血清成分复杂，大部分中国人血清中都含有HBsAb8，对HBsAg具有中和作用；同时血清中存在大量免疫球蛋白、自身抗体、嗜异性天然抗体及补体等成分，可与HBsAg发生中和反应9。本研究用阴性血清配制的稀释系列，目标S/CO值HBsAg滴度随时间变化下降较快，一周内下降10倍以上，不适合作为配制HBsAg质控品基质。抗体阴性血清具有良好的稳定性，备选基质液的稳定性试验中，HBV-B配制的HBsAg阳性血清系列目标S/CO值对应浓度2个月内下降4倍，考虑是抗体阴性血清中混入了低浓度HBsAb，因此实际操作中为减少因灰区因素引起的中和反应，每次收集血清HBsAb的S/CO0.8，配制质控血清前将收集的抗体阴性血清混合液再次用ELISA检测，保证HBsAb为无反应性。使用经再次确认的抗体阴性血清配制的稀释系列，4保存5周和-20保存6个月，目标S/CO值对应稀释度无变化。HBV-B、HBV-C、HBV-D配制的质控血清在-20保存15个月，稳定性良好。在收集抗体阴性血清时，因检测人群中乙肝五项全部阴性者较少，收集用时较长，故收集用具尽可能无菌，配制时无菌操作。利用抗体阴性血清、人血白蛋白和胎牛血清稀释阳性血清制备HBsAg弱阳性质控品方法简单，稳定性良好、经济实用，已经有不少医疗机构进行了尝试和应用10-13。本研究通过比较，认为实验室为保证工作质量，在无法获得有证标准质控品时，使用有效基质配制HBsAg弱阳性质控品是一个良好的补充。参考文献1王治国.临床检验质量控制技术M.北京：人民卫生出版社，2004：207-208.Wang ZG.Quality control technology of clinical laboratory M.Beijing：Peoples Medical Publishing House，2004：207-208.（inChinese）2李金明，王露楠，徐锡霞，等.室内质量控制对乙型肝炎表面抗原测定准确度的影响J.中华检验医学杂志，2001，24（4）：255.Li JM，Wang LN，Xu XX，et al.Effect of indoor quality 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