植物抗病基因结构特点、遗传机理及进化.ppt

植物抗病基因的结构特点、抗性表达遗传机理和进化2011201066张志远抗病基因（R）概念l从广义上讲植物抗病基因(resistancegene)与防御反应基因(defensegene)都是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。所谓抗病基因所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。抗病基因的抗病机理一、基因对基因假说Flor(1971)根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究提出了基因对基因假说。其基本内容是：病原体与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型，亲和与不亲和病原体分别含毒性基因(VIR)和无毒基因(AVR)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携AVR 基因的病原体与携R 基因的寄主互作时，二者表现不亲和，即寄主表现抗病性；其他3种组合则表现为亲和，即寄主感病。抗病基因的抗病机理二、激发子/受体模型(elicitor-receptormodel)激发子/受体模型是从基因对基因假说发展而来的。该模型认为：病原体的AVR基因直接或间接地编码一种配体(激发子)，它与R基因编码的产物(受体)相互作用，从而触发受侵染部位细胞内的信号传递过程，激活其他防卫基因的表达，产生超敏反应。例如，拟南芥抗病基因Rps2编码的受体蛋白与病原体无毒基因AVRRps2编码的蛋白(激发子)相互识别，产生传递信号，引起活性氧中间体的大量聚集，激活其他防卫基因的表达，导致超敏反应，在病原体侵染部位出现枯死斑点症状，使植物获得抗性。抗病基因的抗病机理三、防卫假说(guardhypothesis)防卫假说认为：在病原体侵染植物并营造适合其生长的有利环境时，病原体把植物体内的一种蛋白卫兵(guardee)作为靶子并加以改变，这种改变是植物受到病原体侵害的信号。植物抗病基因蛋白(guard)能检测到这种信号植物卫兵蛋白的改变，其途径可能是通过检测植物卫兵蛋白与病原体毒蛋白形成的复合体。当植物抗病基因蛋白发现其卫兵受到攻击时，抗病性被触发。这个过程可能并不需要抗病基因蛋白和无毒基因蛋白间发生直接的作用。防卫假说中植物抗病基因蛋白不仅能识别无毒基因蛋白，而且能监视被病原体毒性/致病蛋白作为攻击目标的重要植物蛋白/复合体。抗病基因的抗病机理四、信号的产生和传递虽然三个假说的机理不同，但都认为植物的抗病的关键在于植物细胞首先感知胞外信号以及通过膜传入胞内的信号，细胞内信号分子集聚，进一步引起蛋白的磷酸化/去磷酸化反应，信号被传递并且放大，最终增强抗性基因的翻译表达。所以植物抗病，抗病基因发挥着不可替代的作用。抗性基因的结构近年来，由于分子生物学的发展，有很多抗病基因已经被克隆出来，通过序列及氨基酸比对这些抗病基因发现，尽管抗病（R）基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征.根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hml。众多的抗病基因中，有很大一部分的抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）、富含亮氨酸重复(LRR)和亮氨酸拉链（LZ）基序。先对这几个基序的结构作个介绍。核苷酸结合位点（NBS）NBS存在于真核生物的许多蛋白中,如ATPase、延伸因子(elongationfactors)、异质三聚体、GTP结合蛋白(Gproteins)、R基因编码蛋白等,这些蛋白对于细胞的生长、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防御反应都有关键性的作用。尤其是R基因编码产物中NBS的存在，表明R基因的功能之一是磷酸化，通过磷酸化识别配体，导致一系列抗性反应的发生。NBS主要氨基酸的突变可导致抗性的降低或消失。核苷酸结合位点（NBS）lNBS由三个区域组成,第一区域为磷酸结合环(P-loop),又称激酶(kinase)la,作用是结合ATP或GTP的磷酸,第二区域为激酶2,共有特点是4个疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的带负电荷的天冬氨酸,但在植物中,这一区域的两边还具有高保守的氨基酸。值得一提的是,含有TIR的R基因产物激酶2最后一个氨基酸残基为天冬氨酸,而其他为色氨酸。第三区域为激酶3a,与DNA的嘌呤或核糖结合有关,通常含有一个精氨酸残基。(a)RPS4和RPS5中NBS结构域的结构,显示保守基序的位置.蛋白质结构是带状图所示:P-loop(蓝色);RNBS-A(绿);kinase-2(品红);RNBS-B(green);RNBS-C(绿);GLPL(黄);RNBS-D(绿);MHDV(橘黄).富含亮氨酸重复(LRR)富含亮氨酸重复(LRR)因亮氨酸在这一结构中呈规律性重复而得名。LRR存在于多种功能不同的蛋白中,与蛋白质之间的相互作用及信号传导有密切关系。在酵母、果蝇、哺乳动物、人体以及植物中均发现含有LRR结构的蛋白存在。如酵母的腺苷酸环化酶、果蝇的Toll蛋白、人血清中的2-糖蛋白、猪的核糖核酸酶抑制蛋白等都含有LRR结构。在植物中,含LRR的蛋白在细胞生长发育、抗病反应过程中起着重要作用,主要有类受体蛋白激酶、R基因编码蛋白和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。lR基因编码蛋白所含的LRR结构可大至分为两大类:一类是定位于胞外的LRR,如Cf-2,Cf-4,Cf-5,Cf-9,Xa21;另一类是初步定位于细胞质的LRR,主要见于含有NBS的R基因产物中。除甜菜的Hs1Pro-1的LRR比较接近于胞质LRR外,胞质LRR与胞外LRR在重复数和结构上都有明显的区别。从重复数上看,胞外LRR的重复数一般较高,最高可达38个重复,如Cf-2基因。重复单位一般为24个氨基酸残基,并且绝大多数重复的结构相当完整。而胞内LRR重复数一般仅有14个左右,个别也有21和28的。有趣的是,这些重复数均为7的倍数,重复单位所含的氨基酸残基数虽然也大约为24,但为不完整重复。从结构上看,胞外LRR第14位上的残基为甘氨酸,这是其位于胞外的重要特征,另外第17位上的残基为脯氨酸。富含亮氨酸重复(LRR)从猪核糖核酸酶抑制蛋白晶体立体结构中发现,每个LRR的该部分构成了一个短的-折叠片,而其下游的氨基酸残基构成了-螺旋,所有重复的-折叠片平行于共同的轴心,形成一个非球状的马蹄形结构。在这一结构中,保守的亮氨酸残基形成疏水的核心,而其它非保守的氨基酸残基暴露于马蹄形外周而形成了配体结合表面。R基因LRR的结构与之相似,这使我们在一定程度上能够从分子上解释“基因对基因”的相互作用:即保守的亮氨酸形成疏水的与无毒基因编码蛋白配体结合的结构,而非保守区决定了与配体结合的特异性。富含亮氨酸重复(LRR)l根据拟南芥抗病原菌假单胞菌丁香蛋白5（RPS5）中的LRR预测的LRR域结构(a)一个代表性的RPS5LRR域的结构预测。-折叠形成凹脸的“马蹄形”由箭头所示。保守脂肪残留由蓝色表示。N,氨基末端;C,羧基末端.(b)在12个核心蛋白聚糖中富含亮氨酸重复的比对结果和在RPS5中13重复以及氨基端的9个氨基酸。保守脂肪残留，以蓝色显示。富含亮氨酸重复(LRR)亮氨酸拉链（LZ）lLZ存在于一些寡聚蛋白中,许多DNA结合蛋白就含有LZ。LZ中每7个氨基酸残基构成一个重复,第7位置上的残基为(异)亮氨酸。这些(异)亮氨酸在蛋白质二级结构中形成-螺旋的疏水脊,在疏水交互作用下,两个LZ中的(异)亮氨酸残基形似拉链,将其所在的亚基聚合成多聚体。由于LZ的独特的拉链结构,从而有利于蛋白质的二聚化、三聚化,并促进蛋白质之间的特异相互作用。根据结构特征对R基因的分类1)丝氨酸丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域（苏氨酸蛋白质激酶域（STK）R基因如番茄Pto基因，其产物是一个没有LRR结构域，位于细胞质内的典型的丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，该激酶在抗病反应信号传导中通过磷酸化其它信号分子而传导信息。目前已经有证据表明Pto蛋白能与相应无毒基因avrPto的产物相互作用。2）LRR-TM(富亮氨酸重复跨膜受体蛋白)LRR-TM类基因是植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因，该类基因相对保守且以基因簇的形式存在，通常编码一类跨膜受体蛋白(Receptorlikeproteins,RLPs)，编码蛋白由6个保守的结构域组成。l结构域A是N端信号肽，结构域B由N端成熟蛋白和一个亮氨酸拉链LZ基序组成。结构域C由数量不等的LRR重复单元组成，具有LxxLxxLxxLxLxx(N/C/T)x(x)LxGxIPxx。保守序列中，保守的Gly是胞外LRR的重要标志。该结构域参与蛋白质的相互作用和配体识别，不同基因N端胞外结构域LRR重复单元的数量与不同病原菌生理小种激发子的识别特异性有关，它能够直接或间接识别病原菌的激发子而激活寄主的抗病信号传导及防卫反应此外结构域C通常含有许多潜在的糖基化位点(Asn-X-Ser,N-X-S或Asn-X-Thr,N-X-T)，表明RLPs可能是锚定于细胞膜上的糖蛋白受体。跨膜结构域E是由疏水性氨基酸构成的螺旋，两侧的结构域则是由带负电的胞外结构域D和带正电的胞内结构域F组成，这两个结构域对蛋白质在细胞膜上的定位和锚定起着重要的作用。结构域F可能参与胞内信号分子的识别与信号传导，部分RLPs的胞内结构域F还含有一个YXX(为带有疏水性侧链的氨基酸)胞吞信号，它能够激发受体介导的胞吞作用和随后对受体复合物的降解作用。l3)NBS-LRR类R基因的共同特点：在它们编码蛋白的近N端处存在着核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite，NBS)。而在它们的近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，LRR)。LRR是蛋白与蛋白相互作用的一种典型结构，它是由十多个折叠-环-螺旋基本单位串联形成的空间构型，呈蹄铁(horseshoe)状的结构。l这些膜受体的LRR结构伸展于细胞外，蹄铁状结构的凹陷处便是结合多样性配体的部位。该类R基因又可分成3个亚类，即LZNBSLRR亚类，如RPS2、PRS5、RPP8、RPP13、RPM1、Rx2、Prf、Mi基因；TIR-NBS-LRR亚类，如RPS4、RPP5、N、L6、L11、M基因：NBS-LRR亚类，如l2、Xa1、Pib、Bs2、Cre3基因。lNBS-LRR类,位于胞内。多数R蛋白都可归为这类。许多NBS域具有ATP或GTP结合活性,能水解ATP,并可通过磷酸化和去磷酸化调节蛋白的识别功能,而且它具有一些非常保守的氨基酸序列,被广泛用于R基因家族的分类研究,所以可认为NBS域对应的DNA序列区应同样具有保守性,可用已有R基因的保守序列设计引物进行抗病基因类似物(RGA)的克隆。l植物NBS-LRR类蛋白法通过信信号网络途径，并诱发了一系列植物防卫反应，如过氧化酶的激活，丝裂原相关蛋白激酶级联反应，诱导活化病程相关基因，在拟南芥中，至少有三个单独的信号传导途径由NBS-LRR类蛋白激活。l4)LRR-TM-STK类R基因，如水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶，它既含有与Cf-9蛋白相似的胞外LRR受体结构域，又含有与Pto蛋白相似的胞内PK结构域，在这两个区域之间存在一个跨膜区。6)Hm1类R基因为玉米抗HC-毒素基因Hml。玉米圆斑病菌(C.carbonum)1号小种产生HC-毒素，它是一个环状的四肽。当玉米在位点Hml隐性纯合时，该四肽是有毒致命的。研究发现显性的Hml编码HC-毒素还原酶(HCTR)，它依赖于NADPH。虽然Hml被认为是第1个被克隆的小种专化性抗病基因，但它不是真正的抗病基因，因为它的抗病作用并没有一系列的信号传导，HC-毒素合成也不止1个基因。该基因的克隆不仅对玉米圆斑病的防治有重大意义，且对植物抗病基因研究，尤其抗毒素研究具有重大意义抗性表达的遗传植物抗病性遗传的研究是从(Biffen，1905，1912)开始的，他通过杂交试验证明：他试验所用的小麦品种对条锈病的抗病性的遗传表现符合孟德尔定律、为显性单基因遗传。自此以后，抗病育种和抗病性遗传方式的研究逐步开展。抗性表达的遗传可分为三个方面：主效基因、微效基因和胞质遗传。l一、主效基因的遗传主效基因抗病性大多都是垂直抗病性。抗病性程度一般均较高，多能达高抗或免疫。一般的抗病性筛选所选得的抗病基因大多均属主效基因。它们多数在幼苗期就能表现出抗病性，所以可进行苗期鉴定，便于筛选，它们的遗传较简单，便于选育和稳定，所以为抗病育种所使用。它的遗传有以下几个特点。l1显隐性l已研究报道的植物主效基因抗病性大多数均为单基因显性，即抗病性等位基因中有抗病表型效应的基因为显性，写作R，决定感病的为隐性，r，基因型RR和Rr均抗病，只有rr感病。l在很多重要作物病害中都已鉴定出了不少这种抗病基因，在同一植物中已发现了多个基因。l抗病性的显隐性，有时还因环境条件而定。如豌豆对菜豆黄花叶病毒抗病基因的杂合植株在18下抗病，而在27下则表现感病。l有些抗病性基因有剂量效应。如玉米抗大斑病基因Ht，其纯合双倍体HtHt比杂合体Htht抗病性强一些，而三倍体HtHtHt、四倍体HtHtHtHL的抗病程度更依次增强。l显性效应还有时因其遗传背景而异。如Dyck和Samborsky(1968)，曾发现，在品种RedBobs的遗传背景上，Lr的两个等位基因Lr22，Lr24都呈完全显性，但在另一个品种Thatcher的遗传背景上，则Lr22呈半显性，Lr24呈隐性2.主效基因的表型效应l多数情况下，主效基因抗病性决定着高度抗病乃至免疫的表现型，且同一植物的各个抗病基因的表型效应相同。l但也有另外一种情况，即同一种植物的不同主效基因决定着抗病程度不同的表现型。l多数主效基因控制着植株生育全期的抗病性，但有些只能控制一定阶段的抗病性。3复等位性(multiplealleles)亚麻对锈病的抗病性基因已鉴定出26个，但位点(Locus)只有5个，名为L、M、N、P，K，在L位点上等位因子有12个之多，L2、L3、等即是位于l位点上的等位因子。M，N，P上分别有6、3、4个等位因子。复等位因子限制了把不同抗病基因集中到一个双倍体中去的数目，最多两个。4不同位点的抗病基因之间的互作这种互作有上位、互补、抑制，修饰等。小麦对秆锈的抗病基因中，决定较高程度抗病性(反应型0，0，)的基因和抗病性较低(2型)的基因共存于同一基因型时，表现型为0、0；，这就是前者的上位作用。燕麦品种Bond抗冠锈是由两对基因互补来决定的，当与感病品种杂交后，其F2的抗感分离比是9：7，只有AB基因型才能抗病，Abb，aaB，和aabb都不抗病，这就是互补作用。5连锁在植物对高级寄生物的抗病性中，一种植物对一种寄生物的抗病性基因数目常常很多，因而抗病性基因的连锁现象较为常见。不同病害的抗病基因连锁在一起对于选育兼抗品种有利，但如果一种抗病基因和另一种病害的感病基因连锁，或者抗病性基因和某些不良农艺性状连锁，则给抗病育种带来麻烦。二、微效基因抗病性微效基因抗病性的抗病性程度大多只是中等左右，表现为部分抗病性、相对抗病性，或田间抗病性、成株抗病性，且其表现常易受环境条件的影响而波动，在温室或幼苗期不容易鉴定得准确。其遗传较复杂，杂交后代选拔和稳定都较难。这些也正是它不大受喜爱的原因，它最大的或唯一的优点就是它都是水平抗病性，不易“丧失”，能维持较久。它的遗传特点如下：l1.连续变异l微效基因抗病性亲本和感病亲本杂交，F1抗病性各单株间未必一致，但大体均居于双亲平均值左右，F2分离呈连续变异，单株抗病性由弱到强种种不同，变幅颇大，基本上呈正态分布。F3仍呈连续分离，各F3家系的抗病性平均值与其母株F2单株的抗病性大体相关。植株个体的抗病性程度一般按严重度度量，有时也按严重度和反应型的综合指数度量。反应型，表面上似乎是定性差别，其实相邻两级之间还有中间过渡类型，从0型到4型只不过是连续量变中人为给定的定性级别而已。l2.遗传力l遗传力：加性方差占表型方差的比例，从常识上可理解为子代与亲代相似的程度，子代的表现中有多少来自亲代的遗传。其估算方法有多种，微效基因抗病性遗传研究中常用的有亲子回归相关法、方差分析法等。l例如：1967年Hooker报导了玉米对锈病的成株抗病性遗传，他对65个杂交组合的亲本，F1、F2和F3进行了田间抗病性鉴定，结果F1抗病性平均值近于双亲值的平均，F2和F3群体都呈连续的数量变异，说明抗病性为微效基因遗传。这种抗病性的遗传力颇强，在45个组合中均达85以上，表明在抗病育种中可利用。l3.超亲遗传l微效基因抗病性杂种后代分离中，常出现抗病性和感病性超过抗病亲本或感病亲本的个体，这种超亲遗传现象在马铃薯晚疫病、玉米锈病、小麦条锈病中均早有报道。l不仅抗感杂交后代有此现象，而且感病感病的杂交后代中也可能出现。Sharp&Krupinsky(1979)用对小麦条锈病中度抗病甚至感病的品种作了很多组合的杂交，在不少组合都出现了超亲遗传，从F4中选出抗病性比双亲都强的选系。即便感病品种“感病品种，如果组合得宜，也有可能从其后代中选出抗病的后代。这就为微效基因抗病性育种提供了更多的可能性。4.抗病性选择的遗传进度在发病均匀而充分的条件下，对微效基因抗病性杂种后代连续几年进行选择，能逐代提高选系的抗病性程度。理论上，这是使抗病性微效基因不断地、大量地进行重组，从中选出最佳组合，实际上，多种作物的微效基因抗病育种工作中早已取得这方面的成功经验。5.复合杂交和随机多交为了能把大量的微效抗病性基因集中一起，进行多种多样的重组，以提高选育效果，最好进行复合杂交和随机多交。随机多交是Robinson，RA(1976)提出的，他认为这是水平抗病性育种所必需的作法。三、胞质遗传 绝大多数抗病性都是基因决定的，即基因遗传，少数是胞质遗传，抗病与否主要决定与细胞质中的线粒体。最先发现的一例是玉米对小斑病菌T小种的抗病性，它主要决定于胞质。1970年，美国玉米T小种大流行，全玉米带因此减产达15%。T小种是专化于T型胞质雄性不育系（TMS）的特殊小种，凡胞质为T胞质的自交系和杂交种对它都高度感病，产生大形萎蔫性病斑，且产孢甚多。具有正常胞质(normal cytoplasm)的自交系和杂交种对它都有一定抗性，所以说抗病性是胞质决定的。l此外，早在1969年，美国Scheifele等就曾报道过玉米对黄叶枯病(Phylloatictasp.)的抗病性是胞质遗传的，N胞质抗病而T胞质感病。过去此病从来没有严重过，1968年突然严重流行，也是推广T型不育系造成的。l由上述两例看来，对玉米而言，特殊的胞质往往带来特殊的感病性，而此时正常胞质才显示出它的抗病性。这种现象今后还会否在其它作物中出现，是值得注意的。植物抗病性的变异（进化）l植物抗病性的变异，可有广义的和狭义的两种理解l广义：指性状表现上的变化，不论它是环境引起的表型变化还是寄主基因型改变的遗传性变异l狭义：只指寄主基因型改变所致的表型变异，是严格的寄主遗传性变异。今天我们讨论的主要是寄主基因型的变异一、寄主抗病性的遗传性变异变异来源或是基因突变，或是杂交后的基因重组。变异方向或由感病到抗病，或由抗病到感病。变异可能不断有所发生，但能否发展下去，还取决于选择方向和压力。其具体情况又因主效基因和微效基因而有所不同。1.主效基因抗病性的变异由于大多数主效基因抗病性都为显性，所以由抗变感RR-Rr，当时是表现不出来的，要通过以后的杂交重组、产生双隐性个体rr，才得表现。再加上突变率一般都很低，因而这种现象很少为人发现。由感变抗，则只要有病害发生，当代就能显露，尽管突变率很低，却成为抗病育种中从感病品种群体筛选抗病单株的基础之一。当然，生物学混杂、天然杂交也可以使感病品种群体中出现少数抗病性单株。如果撇开人工有意识的单株选择不论，只靠自然选择和一般的人工选择，那么，从群体看，主效基因抗病性的变异速度很慢，甚至很难觉查，对生产和病害防治的影响并不很大。2.微效基因抗病性的变异变异来源和主效基因抗病性相同，但其每个基因的作用很小，一个基因的突变，或基因型有所重组，其表型效应自然比主效基因抗病性的更小。但是，从群体看，微效基因抗病性的变异却较之前者更快一些、更明显一些，在生产和病害防治中更重要一些。这是因为：(1)对微效基因而言，生产上用的品种是严格的或绝对的同质结合(homologous)纯系(pureline)的很少，除非是单倍体育种得来的品种。(2)微效基因抗病性涉及广义的抗病性，涉及的植物性状很广，涉及的基因数目可能很多，自发突变既是不断随机发生的，因而基因突变触及到微效基因抗病性的机会也较多。最常见到的是：同一品种不同产地来源的种子，其后代抗病性常有不同。表5-3 不同种子来源的烟草品种牛津一号对黑胫病抗病性的差异种子来源发病死亡百分率北京98%河南60%山东36%感病对照100%抗病对照0%烟草品种牛津一号是由美国引进的中度抗黑胫病的品种。引入后在北京、山东益都、河南许昌等地试验种植、繁种保存或栽培。若干年后，搜集三地繁殖的种子同时在河南许昌进行抗病性鉴定。三者形态无异，品种无误，均为典型的牛津一号，而抗病性已有了明显的区别。看来，品种逐代繁殖过程中，自然选择和有意识、无意识的人工选择(不一定是选择抗病性)，都可能改变品种内各种细致类型(组分)的比例、改变品种群体的抗病性、甚至改变其微效基因抗病性。Robinson，RA.(1976，1989)关于水平抗病性遗传性变异的论述完全可以用于微效基因抗病性：“水平抗病性是个可变的生存值，在选择压力下它会增长，在无选择压力下它会降低。”l上述的变异（进化）是从表型分析植物抗病性的变异，如果从染色体水平分析植物抗病性的变异，植物抗病基因在进化中形成了几种共有的变异形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异,也导致了新特异性抗病基因的产生。另外,与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样,类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的变异,抗病反应也呈现出多样化,代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。一、抗病基因的复制与重组1、基因复制复制能创造出新基因座,通过序列复制来选择基因成员。例如,对组织相容性的研究表明人与老鼠的相容性区段是染色体复制的结果。相似,cf9基因至少存在两个同源基因簇,暗示着cf类型基因是复制的产物。另外一些抗病基因也显示出基因参与复制的迹象,xa21基因家族中包含着17kb的大重复区段,pto基因家族的复制与分化导致了被编码蛋白的选择性识别能力的产生13。同样亚麻中M基因座是由15个基因成员组成的多拷贝基因座,但亚麻中L基因座是由13个等位基因组成的单拷贝基因。2、重复序列交换改变基因结构基因片段大面积的交换,也导致了基因内基因结构的改变。LRRs编码序列的重复结构有利于基因间或基因内的重组,可能会导致LRR数目的增加或减少,这在M与rpp5基因突变体中已得到证实。野生型的M基因包含多个LRR的编码重复序列,而在自发性突变体中只有1个LRR编码序列,这可能是编码LRRs结构的重复序列发生重组的结果。重组对创造复杂的基因系统起着重要的作用,通过基因重组能创造出亲本等位抗病基因所不具有的新生物型抗病基因。在13个rp1复合体的突变体中被证实有一个抗病谱是与亲本类型不同的。其中8个保持着它们其中一个双亲的生物学特性,暗示着这些变种是由两个或更多的轻微连锁的基因组成的,通过重组而分离;另外,其中4个被证实是新的生物型(即双亲所不具有的)。经遗传分析表明rp1基因新抗病专化型的产生与侧翼标记序列的重组有关。人们也发现已分化的基因家族成员间的重组往往是发生在一段高保守性的序列上。例如,xa21基因座的大范围重组定位与5 端保守性序列上,导致新的启动子或新的基因重组子的产生。相似,基因座M突变子的重组交换位点可能位于LRR重复序列之间的45kb区段上。这暗示着一病原菌株系的抗病基因经过进化能识别另一病原菌株系。未来的基因克隆与对连锁基因的序列分析可最终证实不同病原物的抗性基因有共同的进化起源。3、异位重组Hcr9s基因家族有3个基因座NorthernLights(NL)、MilkyWay(MW)、SouthernCross(SC),都位于番茄1号染色体的短臂上15,在染色体上依次线性排列,基因座MW在另外两者之间,而且相邻两个基因座是互为反向的(基因座的转录方向是相反的)。根据基因序列间的差异把Hcr9s基因家族分为2个亚类:NL基因座专门为一类,SC基因座与MW基因座合为另一类。但有个例外,NL基因座中的NL0C基因出现了其他基因座中特异性序列,暗示着这可能是基因座间重组的结果。两个反向基因座间的染色体内交换引起倒位,那么减数分裂同源染色体的定向分离导致了双着丝粒染色体桥和染色体片段的出现,结果是间插染色体区段出现重复或缺失。最终,基因家族内出现大范围的重组。4、双特异性抗病基因的产生拥有双特异性抗病基因的一个例子是西红柿抗线虫基因Mi。在番茄属植物Lycopersiconperuvianum中的Mi-1基因被证实至少具有7个同源性序列,成簇于650kb区段中。在Mi-1基因座内被证实有两个基因Mi-1.1与Mi-1.2,Mi-1.2基因被认为是线虫纲抗病基因的拷贝,相继的研究表明Mi-1.2拷贝也能对蚜虫产生特异性抗性。据此可推知,Mi-1的双特异性是由基因复制重组产生的。同时也发现西红柿的蚜虫抗性基因Meu1与Mi-1存在着轻微连锁。Mi-1的双特异性体现了它对这两种病虫害具有相似的作用机制。二、类病变坏死突变体一些植物个体在无逆境、损伤或病原物存在的情况下,可自发形成坏死斑,其症状与病斑非常类似,被称为类病变坏死突变体(lesionmimicmutant)。基于各种类病变坏死突变体的研究,类病变坏死突变体的产生可能源自抗病基因座内的重组。由于抗病基因的突变或信号转导途径的改变,以至于对过敏性反应信号的不当传递导致细胞死亡,因此产生类坏死症状。这一假说的最好证据是来自玉米的rp1基因,4个rp1突变体呈现出类病变坏死突变体的表型,其中两个突变体是由基因重组引起的。这一类型的假病斑突变也产生在编码激酶的抗病基因中,像pto或xa21抗病基因。Rathjen等人应用定点突变基因去选择Pto结构域上的氨基酸残基,使得在无毒基因不存在的情况下激酶也能激发起过敏性反应。大麦抗病基因mlo具有广谱抗病性,对几乎所有的白粉病菌的生理小种都具有持久抗性。拟南芥中存在lsd(lesionsimulatingdisease)突变体,其中最早发现的是lsd1突变体,推测LSD1基因编码的LSD1是细胞死亡和防卫反应的负调控因子,与限制防卫反应的启动和过敏性反应发生的程度有关。拟南芥中还存在加速细胞死亡突变体acd(acceleratedcelldeath),acd2突变体可自发的形成类病斑坏死,并组成型表达对病原菌的抗性。这些基因所编码的蛋白结构与已克隆抗病基因的不同,暗示着类病变坏死突变体并不是与抗病基因进化直接相关联,而类病变坏死突变体影响抗病反应的信号转导途径。三、抗病基因识别区域的适应性选择应用抗病基因家族中核酸替换方式的特点可洞悉对特定编码区段的进化与其功能。经研究得出,导致氨基酸改变的核酸替换-异义替换(dn)与没改变氨基酸的核酸替换-同义替换(ds)的比例是个重要信息。在大部分蛋白质基因中,当dn/ds小于1时,肽链中氨基酸的替换受到抑制;相反,dn/ds大于1时,暗示着适应性选择事件的发生,并加速基因间趋异进化。适应性选择的证据很少,但似乎在病原物与寄主的识别功能基因中是普遍存在的。这将预示着在结合配体的识别区域比结构功能区域易发生较强的适应性选择。对11个cf基因家族成员进行分析揭示出LRR结构域中的-折叠(-转角)区段暴露在外的极性残基的编码序列相对于LRR结构域中的其他残基的编码序列的dn/ds之比要高,预示着暴露在外的极性残基在识别配体中起重要作用。与此相似,对基因xa21的LRRs编码区与其基因家族成员xa21D中的作序列同源性比较,发现尽管99.1%的DNA序列是相同的,而两者之间的差异是由LRR编码区的核酸替换造成的,其异义替换显著高于同义替换。大多数模型预示着抗病基因的编码蛋白拥有特异性识别配位能力是基因重组的结果,Meyer等人进一步指出LRR的极性残基的改变对特异性配体识别的改变起决定性作用。同样LRR重复数的增加或减少也可丧失对配体特异性识别的能力,如RB与其RGAs(R-geneanalogs)具有不同的LRR重复数决定着不同的配体识别特异性、RPP5基因与野生型的相比多了4个LRR重复、M基因一个LRR的缺失使得抗性丧失。总的来说,识别配体的编码区顺应于适应性选择。四、通过类转座元促使抗病基因家族成员分化有人认为植物面对环境压力(如组织培养、辐射、病原物侵染)作出反应时,转座元件在基因组重组中扮演着重要的角色。Pouteau等人证实烟草反转录元件Tnt1的转录是被细菌素或真菌素所诱发的,这对上一观点给予了部分支持。转座元件的插入与调节因子的激活,使得编码区段改变了表达能力与基因的表达模式,但这里没有证据说明抗病基因特异性的产生是转座元件的插入的结果。然而,有证据表明转座元件能引起抗病基因的钝化和多样化。例如,玉米圆斑病抗病基因Hm1在其等位基因突变体中发现一个315bp的插入区段。亚麻中L6的两个突变体来自于一个300bp左右钝化因子的插入。水稻中,xa21基因家族的多样性主要是由于类转座元件的出现。17个类转座元件归类为11个家族,包括反向重复转座元件(MITEs)、Ac/Ds型元件、CACTA类似元件和、反转座子等,其中两个元件整合在一起形成一截短蛋白编码序列的可译框架。转座元件Retrofit插入到xa21D基因中并编码缺少跨膜结构域的截短蛋白,令人感兴趣的是这截短蛋白被赋予具有xa21基因转化弱抗病性。xa21基因家族E成员中由于另一转录元件的插入产生了类似于cf抗病基因家族的截短蛋白,其插入到5端与3端的调节区域中。这些类转座元件的转移是对病原物诱导压力的应答,同时也为基因的选择优势提供了可塑性。可见转座元件在植物基因组中的转移加速了抗病基因的进化。然而,转座元件也可能是撕断染色体的内源诱变剂,如插入到Hm1、L6基因座中的转座元件造成了基因组功能的丧失或功能受损。五、抗病基因控制下的抗病反应多样化马铃薯中Rx基因的抗病作用跟许多抗病基因相似也能用诱导受体模型来解释。在Rx基因的抗病过程中,识别过程涉及到RX受体与诱导物-马铃薯X病毒的外壳蛋白的相互作用。但Rx基因控制下的抗病反应不同于其他抗病基因,一个最显著的特征是原先被侵染的细胞在抗病基因作用下快速抑制了病毒的聚积同时没有过敏性反应的产生。为什么Rx基因序列结构类似于过敏性类型的抗病基因而却呈现出独立于过敏性反应的表型?Bendahmane30等人发现如果以CaMV35S启动子表达的PVX弱毒株系的外壳蛋白(CP)作为诱导物,首先诱发的极度抗病并不能阻断外壳蛋白的表达,那么随着外壳蛋白的积累导致了对第二抗病反应-过敏性反应的激发。这暗示着Rx基因有潜力发起过敏性反应,Rx基因的极度抗病可能是导致其过敏性反应和细胞死亡的抗病机制的一种变异。如果以病毒产生的外壳蛋白为诱导物快速诱发极度抗病阻断病毒的复制(也就阻断外壳蛋白的表达),从而抑制了病毒聚积,也就不产生过敏性反应,这说明极度抗病是过敏性反应的上位效应。烟草中N基因的激活比Rx基因慢,也就延迟了对极度抗病的激活,从而病毒聚积导致过敏性反应的产生。番茄中cf9基因主要是抑制菌丝生长,其抗病反应属非过敏性抗病反应,其表现型与抗病性在真菌感染早期循环中的激活相一致。但如果抗病基因的诱发物在病毒载体中表达,则表现出系统过敏性反应,这说明抗病性在病毒感染晚期循环中被激活。可见抗病反应与抗病性激活的时期有关。这些不同的例子的共同特点是植物中的抗病反应处于一个动态的过程。在依赖于诱导物与受体互作的抗病反应中存在着从量变到质变的过程,可以进一步说抗病反应是个连续统一体,植物与病原物相互作用的结果代表着这个连续统一体中的变化点。诱导物与受体的亲和力是抗病反应的主要影响因子。极度抗病反应或非过敏性反应是诱导物与受体高度亲和的表现,代表着连续统一体的一个极端;过敏性反应是诱导物与受体中度亲和的表现,代表着连续统一体的中间阶段;系统过敏性反应是诱导物与受体极不亲和的表现,代表着连续统一体的另一极端。