生物化学与分子生物学实验技术-PPT.ppt

生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术ExperimentaltechnologyofBiochemistryandmolecularbiology成绩分布：成绩分布：理论考试（理论考试（6060分分）实验成绩（实验成绩（4040分分）选择题（选择题（1515分分）判断题（判断题（1010分分）填空题（填空题（1515分分）问答题（问答题（2020分分）Thebasicexperimentaltechnology：一、分光光度技术一、分光光度技术二、层析技术二、层析技术 三、电泳技术三、电泳技术四、离心分析技术四、离心分析技术 五、五、PCR技术技术六、六、蛋白分离和纯化技术蛋白分离和纯化技术一、分光光度技术一、分光光度技术(Spectrophotometry)spektrftmitri Contents：一一)光的概述光的概述二二)分光光度法的概念及原理分光光度法的概念及原理三三)分光光度计的构造分光光度计的构造四四)722)722型分光光度计的使用方法型分光光度计的使用方法五五)测定物含量的计算测定物含量的计算一一)光的概述（光的概述（lightwave）1.1.光的性质光的性质任何一种发光的物体，都称为光源。任何一种发光的物体，都称为光源。光源电偶极子的振荡，在其附近空间产生交变的电磁场，光源电偶极子的振荡，在其附近空间产生交变的电磁场，即辐射出光波。即辐射出光波。光具有光具有波粒波粒二象性：二象性：粒子性（粒子性（微观）（光量子）微观）（光量子）波动性（波动性（宏观）宏观）波长：波长：一个一个“完整的波完整的波”的距离。的距离。频率频率：波源的振动周期（每秒钟振动次数）。波源的振动周期（每秒钟振动次数）。u光是电磁波，通常用波长、频率来描述不同的光波。光是电磁波，通常用波长、频率来描述不同的光波。电磁波谱范围表：电磁波谱范围表：波速波速=波长波长频率频率 不同波长不同波长(或不同频率或不同频率)的电磁波的电磁波在在相同介质相同介质中中的的传播速度传播速度都相同。都相同。一定波长的光波具有一定的能量：一定波长的光波具有一定的能量：电磁波的频率愈高，波长越短。电磁波的频率愈高，波长越短。频率越高（波长越短），光量子的能量越高频率越高（波长越短），光量子的能量越高频率越低（波长越长），光量子的能量越低；频率越低（波长越长），光量子的能量越低；电磁波谱范围表：电磁波谱范围表：“伽玛手术刀”溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系紫外光：紫外光：10-400nm可见光可见光：400760nm红外光：红外光：760-5000000nm另根据电磁波的波长不同又分为三个波段：另根据电磁波的波长不同又分为三个波段：可见光：可见光：电磁波谱中人眼可以感知的部分，波长在电磁波谱中人眼可以感知的部分，波长在400400到到760760纳米之间纳米之间 ，往往是具有颜色的光。，往往是具有颜色的光。实实验验证证明明：白白光光(日日光光、白白炽炽电电灯灯光光、日日光光灯灯光光等等)就就是由以上不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。是由以上不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。白光叫做白光叫做复合光复合光；只具有一种颜色的光只具有一种颜色的光/同一波长的光叫做同一波长的光叫做单色光单色光。溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系 为什么以上多种有颜色的单色光混合在一起即变为白光？为什么以上多种有颜色的单色光混合在一起即变为白光？互补光互补光（complementary colors）：把适当颜色的）：把适当颜色的两种光两种光按一定强度比例混合能成为白光，这两种颜色的光称为按一定强度比例混合能成为白光，这两种颜色的光称为互补光互补光。,kmplimentri u光在介质内传播时，介质中的束缚电子在光波电场作用下做光在介质内传播时，介质中的束缚电子在光波电场作用下做受迫振动，光波要消耗能量激发电子的振动，导致介质中的分受迫振动，光波要消耗能量激发电子的振动，导致介质中的分子（或离子）由基态跃迁到高能级的激发态。子（或离子）由基态跃迁到高能级的激发态。2.2.介质对光波的吸收介质对光波的吸收u光的吸收光的吸收：是指原子在光照下，会吸收光子的能量由：是指原子在光照下，会吸收光子的能量由低能态低能态跃迁到跃迁到高能态高能态的现象。的现象。只要是介质，就会吸收各种光？只要是介质，就会吸收各种光？u介质吸收光的条件：介质吸收光的条件：u物质对光具有选择吸收性。物质对光具有选择吸收性。而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相互作用决定的，不同物质由于其分子结构不同，导致物质能互作用决定的，不同物质由于其分子结构不同，导致物质能态的不同，对光的选择性吸收也就不一样。态的不同，对光的选择性吸收也就不一样。入射光的能量入射光的能量=介质中物质的介质中物质的基态和激发态能量差基态和激发态能量差对对固固体体物物质质来来说说，当当白白光光照照射射到到物物质质上上时时，物物质质对对于于不不同同波波长长的的光光线线吸吸收收、透透过过、反反射射、折折射射的的程程度度不不同同而而使使物物质呈现出不同的颜色。质呈现出不同的颜色。如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如如果果物物质质选选择择性性地地吸吸收收某某些些波波长长的的光光，那那么么，这这种种物物质质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。对对溶溶液液来来说说，溶溶液液呈呈现现不不同同的的颜颜色色，是是由由于于溶溶液液中中的的质质点点(分子或离子分子或离子)选择性的吸收某种颜色的光所引起的。选择性的吸收某种颜色的光所引起的。如如果果各各种种颜颜色色的的光光透透过过程程度度相相同同/不不吸吸收收可可见见光光，这这种种物物质就是无色透明的。质就是无色透明的。但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线如如果果只只让让一一部部分分波波长长的的光光透透过过，其其他他波波长长的的光光被被吸吸收收，则则溶溶液液就就呈呈现现出出透透过过光光的的颜颜色色，也也就就是是溶溶液液呈呈现现的的是是与与它它吸吸收收的的光成互补色的颜色。光成互补色的颜色。（如蛋白质溶液如蛋白质溶液）白光白光(红、青；红、青；橙、青蓝；橙、青蓝；黄、蓝；黄、蓝；绿、紫；绿、紫；)溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系用眼睛观察、比较溶液颜色深度以用眼睛观察、比较溶液颜色深度以大致估计大致估计物质含量的物质含量的方法称为方法称为目视比色法目视比色法。物质吸收光能的多少与什么有关系？物质吸收光能的多少与什么有关系？利用物质能吸收光能的原理以利用物质能吸收光能的原理以精确测定精确测定物质含量的方法物质含量的方法分光光度法分光光度法二二)分光光度法的概念及原理分光光度法的概念及原理1.分光光度法的概念分光光度法的概念当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有部分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质部分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质后后光能被减少光能被减少。这种利用。这种利用光能的吸收和透过比例光能的吸收和透过比例来来进行某些物质的进行某些物质的定性定量定性定量分析。分析。1.1.灵敏度高灵敏度高 分分光光光光度度法法测测定定物物质质的的浓浓度度下下限限(最最低低浓浓度度)一一般般可可达达1-10-3%的微量组分。的微量组分。2.分光光度法的特点分光光度法的特点2.2.准确度较高准确度较高 一般分光光度法的一般分光光度法的相对误差为相对误差为2-5%2-5%。3.3.操作简便，测定速度快操作简便，测定速度快4.4.应用广泛应用广泛 几几乎乎所所有有的的无无机机离离子子和和有有机机化化合合物物都都可可直直接接或或间间接接地地用用分光光度法进行测定。分光光度法进行测定。入射光入射光 I0 吸收吸收Ia 透射透射It I0=Ia+It+Ir I0=Ia+It1.透光率透光率(T)和吸光度和吸光度(A)3.分光光度法的原理分光光度法的原理透光率透光率(transmittance)T=It/I0 吸光度吸光度(absorbance)trnsmitns bs:bns2.Lambert-Beer定律定律（1）Lambert定律定律:C一定一定,A L（2）Beer定律定律:L一定一定,A c（3）Lambert-Beer定律定律:K为吸光系数，对于一定物质的溶液为吸光系数，对于一定物质的溶液K为常数。为常数。A=KLA=KCA=KCLt三三)分光光度计的构造分光光度计的构造 能从含有各种波长的能从含有各种波长的混合光混合光中将每一中将每一单色光单色光分离出来并分离出来并测量其强度测量其强度的仪器称为分光光度计的仪器称为分光光度计。分光光度计因使用的波长范围不同而分为：分光光度计因使用的波长范围不同而分为：紫外光紫外光分光光度计分光光度计 可见光可见光分光光度计分光光度计 红外光红外光分光光度计分光光度计 万用万用（全波段）分光光度计（全波段）分光光度计透射光能透射光能 1.光源光源：要求能提供所需波长范围的连续光谱，要求能提供所需波长范围的连续光谱，（钨灯、氢（钨灯、氢灯）通常用灯）通常用612 V钨丝灯作钨丝灯作可见光区可见光区的光源，发出的连续的光源，发出的连续光谱在光谱在360800nm范围内。范围内。光源应该稳定，一般通常在仪器内同时配有光源应该稳定，一般通常在仪器内同时配有电源稳压器电源稳压器。无论哪一类分光光度计都由下列部分组成：无论哪一类分光光度计都由下列部分组成：透射光能透射光能 2.单色器单色器：单色器的作用是将光源发出的连续光谱单色器的作用是将光源发出的连续光谱（复合（复合光）分解为单色光的装置光）分解为单色光的装置。分为分为棱镜棱镜和和光栅光栅。原理：都是将原理：都是将复合光复合光色散为不同波长的色散为不同波长的单色光单色光，然后再让所，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400透射光能透射光能3.比色皿：也称吸收池比色皿：也称吸收池 用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和和5 cm。可见光可见光分光光度计分光光度计玻璃玻璃比色皿比色皿紫外光紫外光分光光度计分光光度计石英石英比色皿比色皿透射光能透射光能4.检测器：检测器：检测器的作用是接受从比色皿发出的检测器的作用是接受从比色皿发出的透射透射光光并转换成并转换成电信号电信号进行测量。进行测量。分为分为光电管光电管和和光电倍增管光电倍增管光能光能 电能电能 光电管光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。管。光电管装有一个阴极和一个阳极。光电管装有一个阴极和一个阳极。对光敏感的金属对光敏感的金属透射光能透射光能5.显示装置：显示装置：显示装置的作用是把放大的信号以吸光度显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透或透光率光率T的方式显示或记录下来。的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字数字显示记录仪显示记录仪。四四)722)722型分光光度计的使用方法型分光光度计的使用方法722型（触摸键式）型（触摸键式）722型（旋钮式）型（旋钮式）722型（触摸键式）型（触摸键式）1.开电，预热开电，预热20分钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.装液（装液（2/3）波长旋钮波长旋钮光路光路722型（触摸键式）型（触摸键式）1.开电，预热开电，预热20分钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.装液（装液（2/3）4.功能键置功能键置“T”调调“T”为为0（遮光体遮光体对对准光缝）准光缝）功能键功能键722型（触摸键式）型（触摸键式）1.1.开电，预热开电，预热2020分钟；分钟；2.2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.3.装液（装液（2/32/3）4.4.功能键置功能键置“T T”调调“T T”为为0 0（遮光体遮光体对准光缝）对准光缝）5.5.功能键置功能键置“T T”调调“T T”为为100100（空白管空白管对准光缝）对准光缝）6.6.功能键置功能键置“A A”依次拉动拉杆（听到依次拉动拉杆（听到“咔咔”一声）比一声）比色、读数并记录（色、读数并记录（A A值取三位有效数值）值取三位有效数值）7.洗涤比色皿洗涤比色皿功能键功能键722型（旋钮式）型（旋钮式）1.开电，预热开电，预热20分钟；分钟；2.调调“”选择所需波长选择所需波长3.装液（装液（2/3）4.功能选择扭置功能选择扭置T，调，调“T”为为0（开盖），调（开盖），调“T”为为100（关盖（关盖且空白管对准光缝）且空白管对准光缝）5.功能选择扭置功能选择扭置A（为（为0时方可测定读数）时方可测定读数）6.依次拉动拉杆（听到依次拉动拉杆（听到“咔咔”一声）一声）比色、读数并记录（比色、读数并记录（A值值取三位有效数值）取三位有效数值）7.洗涤比色皿洗涤比色皿722分光光度计使用注意事项：分光光度计使用注意事项：1.样品室盖应样品室盖应轻开轻放轻开轻放；2.比色皿拿比色皿拿磨砂面磨砂面，液体装入约，液体装入约2/3高度高度，并，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；干净，倒置于滤纸上；3.倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器仪器上请勿放任何物品上请勿放任何物品；五）测定物含量的计算五）测定物含量的计算标准管法标准管法标准曲线法标准曲线法1.标准管法标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）1.01/20稀释标准血清（ml）1.0生理盐水（ml）1.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.0参比参比（空白）（空白）溶液溶液 blank：参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。StandardsampleUnknownsample 1.标准管法标准管法空白管(B)标准管(S)测定管(U)1/20稀释血清标本（ml）1.01/20稀释标准血清（ml）1.0生理盐水（ml）1.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.0As=Ks Cs LsAu=Ku.Cu.LuAs Ks Cs LsAu Ku.Cu.Lu=As.Cs.Au Cu.=2.标准曲线法标准曲线法试管试管1 12 23 34 45 5浓度（浓度（C=C=g/mlg/ml）10102020303040405050吸光度（吸光度（A A）0.0710.0710.1550.1550.2230.2230.2720.2720.3660.3660.1000.5000.4000.3000.200.1020304050g/mlA备注：备注：1.标准曲线应在短期使用标准曲线应在短期使用（一个月），即标明日期（一个月），即标明日期及气温；及气温；2.标准曲线的制作与测定标准曲线的制作与测定管测定应在同一台仪器上管测定应在同一台仪器上进行；进行；AU=0.186CU=23.2g/ml未知物的未知物的吸光度吸光度未知物的未知物的浓度浓度二、层析技术二、层析技术ChromatographyTechnique,krmtgrfi tekni:kContents:一一)层析技术的概念层析技术的概念二二)层析技术的原理层析技术的原理三三)层析技术的分类层析技术的分类四四)凝胶层析技术凝胶层析技术一）层析技术的概念一）层析技术的概念n利用混合物中各组分的利用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质差异，使差异，使各组分在层析系统中以各组分在层析系统中以不同速度不同速度移动而达到分移动而达到分离的一种离的一种物理分离方法物理分离方法。混合物混合物A B C D层析技术早在层析技术早在19031903年就应用于年就应用于植物色素植物色素的分离提取，各种颜色的分离提取，各种颜色的色素从上到下在吸附滤纸上排列成色谱，也称的色素从上到下在吸附滤纸上排列成色谱，也称色谱法色谱法。二）层析技术的原理二）层析技术的原理理化性质：理化性质：吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数分子亲和力以及分配系数。利用混合物中各组分利用混合物中各组分理化性质理化性质差异进行分离差异进行分离;固定相固定相流动相流动相固定不动（固定不动（液液/固固）针对固定相针对固定相（相对运动相对运动）（气）（气/液）液）推动样品中各组分通过固定相向前移动推动样品中各组分通过固定相向前移动层析系统层析系统n当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中进行在两相中进行再分配再分配。n分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。组分，从而达到将各组分分离的目的。（1 1）按两相所处的状态分类：）按两相所处的状态分类：三）层析技术的分类三）层析技术的分类液相色谱液相色谱气相色谱气相色谱固定相固定相流动相流动相固定不动（固定不动（液液/固固）针对固定相针对固定相（相对运动相对运动）（气）（气/液）液）层析系统层析系统液液-固层析固层析液液-液层析液层析气气-固层析固层析气气-液层析液层析高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较气相色谱法气相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法流动相流动相惰性气体惰性气体极性的液体极性的液体分离物质分离物质气体和沸点较低的化合物气体和沸点较低的化合物（占有机物总数的（占有机物总数的2020）高沸点、热稳定性差、摩尔质量高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质大的物质(占有机物总数近占有机物总数近8080)温度条件温度条件高温下高温下室温条件室温条件n目前目前高效液相色谱法高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。n高效液相色谱法的高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵仪器设备费用昂贵，操作严格操作严格，这是它的主，这是它的主要缺点。要缺点。柱层析柱层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析（2 2）按操作形式不同分类：）按操作形式不同分类：吸附层析：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分利用吸附剂表面对不同组分吸附性能吸附性能的的 差异，达到分离鉴定的目的。差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的利用不同组分在流动相和固定相之间的 分配系数分配系数（或溶解度）（或溶解度）不同，使之分离。不同，使之分离。离子交换层析：离子交换层析：利用不同组分对利用不同组分对离子交换剂亲和力离子交换剂亲和力的的 不同。不同。凝胶层析：凝胶层析：利用某些凝胶对于不同利用某些凝胶对于不同分子大小分子大小的组分阻的组分阻 滞作用的不同。滞作用的不同。（3 3）按层析原理分类：）按层析原理分类：四）凝胶层析技术四）凝胶层析技术 优点：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等。实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等。因此凝胶层析技术广泛用于蛋白质（包括酶）、因此凝胶层析技术广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的核酸、多糖等生物分子的分离纯化分离纯化，同时还应用于，同时还应用于蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。、脱盐、样品浓缩等。凝胶层析：凝胶层析：凝胶颗粒多孔板凝胶（凝胶（琼脂糖琼脂糖/葡聚糖葡聚糖/聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺）液体液体（洗脱液）（洗脱液）固定相固定相流动相流动相多聚葡萄糖多聚葡萄糖与与环氧丙烷环氧丙烷交联交联原理：原理：混合物中各组分按其混合物中各组分按其分分子颗粒大小不同子颗粒大小不同而被分而被分离的技术。离的技术。凝胶层析又称凝胶层析又称分子筛层析分子筛层析或或排阻层析排阻层析大分子大分子排阻限排阻限小分子小分子渗入限渗入限例如从蛋白质溶液中除去无机盐：例如从蛋白质溶液中除去无机盐：蛋白质的分子量蛋白质的分子量 5000D5000D无机盐的分子量：几十到几百无机盐的分子量：几十到几百SephadexSephadex G-25 G-25凝胶作为分离固定相，分离范围是凝胶作为分离固定相，分离范围是100010005000D5000D。被分离的两组物质的分子量正好落被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的在分离范围的两侧两侧。大分子组为大分子组为全排阻全排阻，而小分子组为，而小分子组为全渗入全渗入。凝胶的选择：凝胶的选择：葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)影响凝胶层析效果的因素：影响凝胶层析效果的因素：1 1层析柱的选择层析柱的选择 层析柱大小层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的一般来讲，主要是层析柱的长度长度对分辨率影响较大，对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。些困难。2.2.装柱装柱不能有气泡！不能有气泡！加样量对实验结果也可能造成较大的影响：加样量对实验结果也可能造成较大的影响：加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。另外加样前要注意另外加样前要注意：样品中样品中有有不溶物必须在上样前去掉，以不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品黏度不能过大，否则会影响分离效果。免污染凝胶柱。样品黏度不能过大，否则会影响分离效果。3.3.加样量加样量4.4.洗脱速度洗脱速度 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。度要恒定而且合适。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散。但洗脱速度过慢会造成样品扩散。一般凝胶的流速是一般凝胶的流速是2 210 ml10 mlh h，市售的凝胶一般会，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。都要根据具体的实验要求来选择。凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作 有两次实验操作练习！有两次实验操作练习！