SDS-PAGE检测蛋白质纯度.doc

SDS-PAGE检测蛋白质纯度1 电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 2 影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH 当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH86的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。 2.2 缓冲液的离子强度 离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。所以常用离子强度为0.02-0.2之间。 2.3 电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。2.4 电渗作用 在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。 2.5 对支持物的选择 一般要求支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱均无法重复。如纸电泳时，滤纸厚薄不均匀或吸附力过大，则蛋白质或其他胶体颗粒在它们泳动过程中有一部分被滤纸吸附，造成分离区带蛋白含量相对量降低。因此，电泳前应事先处理滤纸，以减低滤纸的吸附能力，可取得较好的分离效果。若选用Whatwan No1号滤纸或国产新华滤纸，一般不需要进行预处理。2.6 温度对电泳的影响 电泳过程中由于通电产生焦尔热，热对电泳有很大的影响。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移率增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可在电泳系统中安装冷却散热装置。3 电泳的分类3.1 按分离原理分类 可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种。1） 区带电泳 电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。2） 移界电泳 是Tiselius最早建立的电泳，它是在U型管中进行的，由于分离效果较差，已为其它电泳技术所取代。3） 等速电泳 需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。4） 等电聚焦 由于具不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面看与区带电泳相似，但原理不同。3.2 区带电泳的分类1） 按支持物物理性状分类 1. 滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 3. 凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。2） 按支持物的装置形式不同分类 1. 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2. 垂直板式电泳。3. 连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。3） 按pH的连续性不同分类 1. 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 2. 不连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。不连续电泳与连续电泳的主要区别在于前者有两层不同孔径的凝胶系统；电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同；电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。4 几种常见的电泳方法4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N，N-methylene-bis-acrylamide，简称Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，用样量少（1-100g）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基分子量。聚丙烯酰胺的聚合反应及其结构如下：图 APS引发TEMED催化Acr与Bis的聚合反应Acr或Bis无论单独存在或混合在一起都是稳定的，一旦出现自由基团时，就会发生聚合反应。自由基团的引发有化学和光合两种方法，化学法的引发剂是过硫酸胺（简称Aps），催化剂为四甲基乙二胺（简称TEMED）；光化学法是在光线照射下，由光敏感物质核黄素来引发，催化剂也是TEMED。由于单体及交联剂、引发剂和催化剂的浓度、比例、聚合条件等的不同，便可产生不同孔径的凝胶。一般而言，凝胶浓度愈大，交联度愈大孔径愈小。凝胶浓度的选择与被分离物分子量及其性质有关，其大致选用范围如下表：表: 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质 510520 3015 2010 155 10 2 5核酸（RNA）蛋白质-甘氨酸-。由于Cl-的快速移动，使在Cl-后面胶层中的离子浓度骤然降低，形成一个低电导或称高电位梯度（电位差）区域（电势梯度E=电流强度I/电导率），因为电泳速度取决于电位差和有效迁移率，所以在此区域中，使蛋白质离子及甘氨酸离子加速向阳极移动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，则3种离子移动速度相同。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说，在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面（见图24）。由于蛋白质离子的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成很窄的薄层。此浓缩效应使蛋白质浓缩了数百倍。在分离胶层中，因缓冲液pH为8.9，甘氨酸进入此胶层后，其解离度大大增加，它的迁移率几乎与Cl-接近。此外，分离胶孔径小，蛋白质在泳动时，所受阻力较浓缩胶中大，移动缓慢。由于这两个原因，使甘氨酸离子在分离胶中有效迁移率超过蛋白质离子，导致分离胶不具备浓缩胶效应，而只有分离效应。 2. 分子筛效应 由于在凝胶电泳中，凝胶浓度不同，其网的孔径大小也不同，可通过的蛋白质分子量范围也就不同。在分离胶中孔径较小，分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，从而引起泳动速度的变化，所以多种蛋白质即使所带电荷相同，迁移率相等，在聚丙烯酰胺中经一定时间泳动后，也能彼此分开。大分子受阻程度大，走在后面，小分子受阻小，走在前面。 3. 电荷效应 由于各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同，它们在浓缩胶和分离胶交界处被浓缩成狭窄区带，仍以一定程序排列成各自的小圆盘状，紧接在一起。当它们进入分离胶时，由于电泳体系已处于一个均一的连续状态中，故此时以电荷效应为主，带不同电荷的蛋白质离子按其移动速度大小顺次分离。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）PAGE电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。然而有时两个分子量不同的蛋白质，由于其分子大小的差异、被它们所带电荷的差别补偿而以相同的速度向阳极移动，因而不能达到分离的目的。SDS-PAGE就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度。 SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关。5染色方法 经醋酸纤维薄膜、琼脂（糖）、聚丙烯酰胺电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持物相应位置上显示出谱带，从而检测其纯度、含量及生物活性。蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法，现分别介绍如下：5.1 蛋白质染色 染色液种类繁多，各种染色液染色原理不同，灵敏度各异。使用时可根据需要加以选择。常用的染色液有： 1. 氨基黑10B 氨基黑10B分子式为C22H13N6S3Na3，MW715，max=620-630nm，是酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料之一，但对SDS-蛋白质染色效果不好。另外，氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度不等、色调不一（有蓝、黑、棕等）；作同一凝胶柱的扫描时，误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线，更有利于定量测定。 2. 考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝R250的分子式为 C14H44O7H3S2Na，MW=824，max=560-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超过一定范围时，对高浓度蛋白质染色不合乎Beer定律，作定量分析时要注意这点。 3. 考马斯亮蓝 G250 考马斯亮蓝 G250比R250多二个甲基。 MW=854，max590-610 nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色，所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。 4. 固绿 固绿分子式为 C37H31N2O10S3Na2，MW 808，max=625 nm，酸性染料。染色灵敏度不如 考马斯亮蓝，近似于氨基黑，但却可克服 考马斯亮蓝在脱色时易溶解出来的缺点。 5. 荧光染料 略 6. 银染色法 此法较考马斯亮蓝灵敏100倍。但染色机制尚不清楚，可能与摄影过程中Ag+的还原相似。 7. 广谱染料（stains-all）染色法5.2 糖蛋白染色 1. 过碘酸-Schiff试剂 2. 阿尔山蓝染色5.3 脂蛋白染色 1. 油红O染色 2. 苏丹黑 B实验一 SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的纯度 目的要求 学习SDS-PAGE测定蛋白质纯度的原理和方法；掌握SDS-PAGE的其他应用原理 SDSPAGE是PAGE的一种特殊形式，有关理论如上所述。 SDS是带负电荷的阴离子去污剂。用SDS-PAGE测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。因此各种蛋白质分子在SDSPAGE中，只能按其分子量大小而分离。 SDSPAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。操作步骤 一、安装夹心式垂直板电泳槽 1装上贮槽和固定螺丝钉，仰放在桌面上。2将长、短玻璃板分别插到硅橡胶框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。3 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。4 将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。5 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂，以封住空隙，加琼脂溶液时，应防止气泡进入。 二、配胶及凝胶板的制备1配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDSPAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表1、2。表1SDS-不连续体系凝胶配制试剂名称20mL分离胶所需试剂用量（mL）浓缩胶试剂用量5%7.5%10%15%5% 分离胶贮液 30%Acr-0.8%Bis分离胶缓冲液pH8.9 Tris-HCl浓缩胶贮液 10%Acr-0.5%Bis浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl10%SDS3.332.500.205.002.500.206.662.500.2010.002.500.200.65ml1.00ml0.08ml1%TEMED2.002.002.002.00TEMED原液5uL双蒸水11.8710.28.545.2050%甘油2.3mL10%APS0.100.100.100.10 0.06 mL电极缓冲液为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。表2 略 2凝胶板的制备 （1）SDS-不连续体系凝胶板的制备 分离胶的制备： 按表1配制20 mL7.5聚丙烯酰胺，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm高，用1mL移液器取少许水饱和正丁醇，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3-4mm高，以隔离空气。约30min后，凝胶与水饱和正丁醇层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水饱和正丁醇，再用滤纸条吸去多余水分。 浓缩胶的制备：按表1浓缩胶配制方法配制 4mL 5聚丙烯酰胺，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30 min后凝胶聚合。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 三、样品的处理与加样 1样品的处理 根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液；自己配制标准及未知样品，按0.5-1mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20冰箱保存较长时间，使用前在10O沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合。 2加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为1015L（即 2-10g蛋白）。如样品较稀，加样体积可达100L。如样品槽中有气泡，可用注射器针头排除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 四、电泳 不连续系统：在电极槽中倒入 pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液，内含 0.1 SDS即可进行电泳。电泳条件：开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为20-30mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。 五、凝胶板剥离与固定 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志。将凝胶板放在大培养皿内。 六、染色与脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 七、绘制标准曲线 将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm）。按下式计算相对迁移率mR： 相对迁移率mR =蛋白样品距加样端距离/溴酚蓝区带中心距加样端距离 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。注意事项1SDS纯度2SDS与蛋白的结合量3凝胶浓度：应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。分子量在 25 000 200 000的蛋白质选用终浓度为5的凝胶；分子量在1000070000的蛋白质选用终浓度为10的凝胶；分子量在1000050000的蛋白质选用终浓度为15的凝胶，在此范围内样品分子量的对数与迁移率呈直线关系。以上各种凝胶浓度其交联度都应是2.6。 标准蛋白质的相对迁移率最好在0.20.8之间均匀分布。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽键的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。 4对样品的要求：应采用低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以1015 L为宜，如样品系较稀的液体，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。 5由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。 试剂1. 标准蛋白质 目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDSPAGE测定未知蛋白质分子量。 2不连续体系SDSPAGE有关试剂 （1）10SDS溶液： 称5g SDS，加双蒸水至50 mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。用前微热，使SDS完全溶解。（2）l% TEMED： 取1mL TEMED，加双蒸水至100mL，置棕色瓶中，4贮存。 （3）10APS： 称APS 1g加双蒸水至10mL。最好临用前配制。 （4）样品溶解液： 内含1SDS，1巯基乙醇，40蔗糖或20甘油，0.02溴酚蓝，0.01mol/L pH8.0 TrisHCl缓冲液。 （5）凝胶贮液 30分离胶贮液： 称 Acr 30g及 Bis 0.8g，溶于双蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。 10浓缩胶贮液： 称 Acr 10g及Bis 0.5g，溶于双蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。 （6）凝胶缓冲液 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9 TrisHCl缓冲液）： 称 Tris 36.3g加少许双蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48mL，调pH至8.9，最后加双蒸水定容至100 mL，4贮存。 浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.7 TrisHCl缓冲液）： 称 Tris 6.0g，加少许双蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48mL，调 pH至 6.7。最后用双蒸水定容至100mL，4贮存。 （7）电极缓冲液（内含 0.l%SDS，0.05 mol/L Tris0.384 mol/L甘氨酸缓冲液 pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。 4固定液 取50%甲醇454mL，冰乙酸 46mL混匀。 5染色液 称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250mL，过滤后应用。 6脱色液冰乙酸75mL，甲醇 50mL，加蒸馏水定容至1000mL。表1SDS-不连续体系凝胶配制试剂名称20mL分离胶所需试剂用量（mL）浓缩胶试剂用量5%7.5%10%15%5% 分离胶贮液 30%Acr-0.8%Bis分离胶缓冲液pH8.9 Tris-HCl浓缩胶贮液 10%Acr-0.5%Bis浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl10%SDS3.332.500.205.002.500.206.662.500.2010.002.500.200.65ml1.00ml0.08ml1%TEMED2.002.002.002.00TEMED原液5uL双蒸水11.8710.28.545.2050%甘油2.3mL10%APS0.100.100.100.10 0.06 mL