检高-蛋白质和氨基酸测定.doc

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北京一轻高级技术学校教案

任课教师： 吴昊 科 目: 食品检验技术 编号: 13
授 课 章

节 名 称
第四章
第六节 蛋白质和氨基酸的测定
审 批 签 字

授课班级
10食检（1）（2）班
授课时数
2
授课时间
第九周（1）
授课方法
讨论法、讲授法
教　具
多媒体

教学目的
及　要　求

1、了解蛋白质测定的常用方法。
2、知道每种测定方法的原理及优缺点。

教学重点、
难点

重点:测定方法的原理和优缺点
难点：每种方法的应用与选择.
作业
P133
18，19

教 　 学　 过　 程
【复习提问】

1。 测定还原糖的方法有哪些？
2. 淀粉测定的方法有哪些?各种方法的原理分别是什么?

【引入新课】

通过上节课的学习，同学们了解了食品中另一类重要能量物质碳水化合物的测定方法。这节课我们来共同学习蛋白质和维生素的测定.

教 学 后 记

教 案 纸
教学内容、组织、教法、要求
说明
【新课】 第六节 蛋白质和氨基酸的测定
一、蛋白质的测定
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等;含氮类脂、卟啉和含氮的色素）.
食品和其原料中蛋白质含量的测定,主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测)。
蛋白质是生命的物质基础,人体11％~13％总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同.
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。
蛋白质的测定方法分两大类：
一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因

学生对蛋白质和氨基酸分类有简要了解

要求学生知道测定蛋白质的意义，以及测定蛋白质的主要方法。

教 案 纸
教学内容、组织、教法、要求
说明
以及芳香基团等测定蛋白质含量.
具体测定方法：
凯氏定氮法—-最常用的,国内外应用普遍。
双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法
国外: 红外分析仪
氨基酸总量-—酸碱滴定法测定.
各种氨基酸的分离与定量--色谱技术。
有多种氨基酸分析仪。
1、 凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出,现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种.
（1） 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
①　用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定.根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。

要求学生理解测定的原理,对测定范围、测定方法、测定的具体操作步骤有简要了解。

教 案 纸
教学内容、组织、教法、要求
说明
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
ü . 消化
总反应式:
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 -（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
一定要用浓硫酸（98％）
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340℃,加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂.还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂)。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵)、硒粉、二氧化钛.
〈3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。

重点掌握测定原理及每种方法的优缺点.
及每种方法使用的情况。

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教学内容、组织、教法、要求
说明
ü 蒸馏
消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。
ü 吸收与滴定
<1〉用4％硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。
指示剂 红色 绿色 红色
（酸） （碱） （酸)
〈2〉 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收,再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂.
说明：
① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
② 消化时不要用强火,应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失
③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下,并促进其消化完全。
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度.
⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。

重点介绍原理和特点，将实验中的注意事项详细讲解，可以让学生阅读后进行总结

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说明
⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。
⑦ -般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间.有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧ 蒸馏装置不能漏气.
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀,此时需再增加氢氧化钠用量。
氢氧化铜在70～90℃时发黑。
⑩ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸.
2、微量凯氏定氮法
(1）、原理及适用范围同前
（2）、与常量法不同点:
加入硼酸量有50 ml ——10 ml,
滴定用盐酸浓度由0。1 mol/L —— 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。

要求学生掌握测定原理及每种方法的优缺点.
及每种方法使用的情况。

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说明
3、双缩脲法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。
新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、 染料结合法、水杨酸比色法等。
ü 原理
脲(尿素）NH2-CO—NH2 加热至150~160℃时,两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物,这种反应叫双缩脲反应。(缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 —CO-NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下,其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。(560nm）
注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化
ü 方法特点及应用范围
本法灵敏度较低，但操作简单快速,故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定.
ü 主要仪器: 分光光度计,离心机(4000 r/min）
ü 试剂：
（1)碱性硫酸铜溶液 (2)四氯化碳
ü 操作方法:采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线.

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说明
二、氨基酸含量测定
（一）甲醛滴定法
1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有酸性 -COOH 基,成中性内盐，加入甲醛溶液后,与 —NH2— 结合,碱性消失，再用强碱来滴定 —COOH 基。
2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。(适于食品中游离氨基酸的测定）
3．主要试剂：
① 40％中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用
氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。
② 0。1％百里酚酞乙醇溶液,
③ 0。1％中性红50%乙醇溶液，
④ 0。1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：同时取两份样：
① 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴,中和样液中其它酸性物质.
② 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和二者之差可计算氨基酸含量
（二）茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。
【总结】
通过本节课的学习,同学们了解到蛋白质的分类,测定蛋白质的方法及意义。知道了食品中蛋白质和个氨基酸测定过程中

老师以提问的方式与学生共同总结整节课的主要内容和重要知识点

布置作业

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教学内容、组织、教法、要求
说明
的具体方法和注意事项，更重要的是学会区分每种方法适用的情况。
【作业】
1、蛋白质是什么?凯氏定氮法的原理是什么？
2、在消化过程中添加硫酸的作用是什么？

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