常规病理组织处理.ppt
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1、病理常规组织处理病理常规组织处理n 组织标本离体后,要经过固定、脱水、透明、组织标本离体后,要经过固定、脱水、透明、组织标本离体后,要经过固定、脱水、透明、组织标本离体后,要经过固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等一系列的后续处理。组织处理的每浸蜡和包埋等一系列的后续处理。组织处理的每浸蜡和包埋等一系列的后续处理。组织处理的每浸蜡和包埋等一系列的后续处理。组织处理的每一个步骤都非常重要。一个步骤都非常重要。一个步骤都非常重要。一个步骤都非常重要。n n因为标本的取材,部位的选择等等,都或多或少因为标本的取材,部位的选择等等,都或多或少因为标本的取材,部位的选择等等,都或多或少因为标本的取材,部位的选
2、择等等,都或多或少地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最终的诊断是否合适终的诊断是否合适终的诊断是否合适终的诊断是否合适n n组织结构的保存、有效成分的保留,取决于组织组织结构的保存、有效成分的保留,取决于组织组织结构的保存、有效成分的保留,取决于组织组织结构的保存、有效成分的保留,取决于组织处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。为病理诊
3、断提供优质的切片需要技术人员在日常为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常的工作中不断积累熟练的技巧和经验。的工作中不断积累熟练的技巧和经验。的工作中不断积累熟练的技巧和经验。的工作中不断积累熟练的技巧和经验。一一.固定固定n n 病理标本的制作和组织处理都必病理标本的制作和组织处理都必须先进行固定。如果固定不佳,制片须先进行固定。如果固定不佳,制片的其它程序将非常困难,可以说没有的其它程序将非常困难,可以说没有很好的固定就没有很好的很好的固定就没有很好的HEHE染色,就染色,就会造成诊断困难,甚至误诊,这足
4、以会造成诊断困难,甚至误诊,这足以证明固定的重要性证明固定的重要性概念:组织离体后,采用某些办法使其概念:组织离体后,采用某些办法使其细胞内物质尽可能接近其生活状态时细胞内物质尽可能接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。(应用各的形态结构和位置的过程。(应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程)状态的过程)目的:防止组织细胞自溶和腐败,保持目的:防止组织细胞自溶和腐败,保持细胞内成分(蛋白质、脂肪、碳水化细胞内成分(蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类)与原有的结构与生活时合物或酶类)与原有的结构与生活时相仿。相仿。方法:n n1.物理学方法:如低温冷冻,干
5、冰物理学方法:如低温冷冻,干冰(dryice,即固态无水碳酸)冰冻真空,即固态无水碳酸)冰冻真空脱水,石蜡渗入法。脱水,石蜡渗入法。n n2.化学方法:采用各种化学溶液作固定化学方法:采用各种化学溶液作固定液,使组织细胞进入固定状态。这是液,使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。国内最常用的方法。注意:n n1.1.组织离体及时固定(大标本切开固定)组织离体及时固定(大标本切开固定)组织离体及时固定(大标本切开固定)组织离体及时固定(大标本切开固定)n n2.2.组织块大小适宜(组织块大小适宜(组织块大小适宜(组织块大小适宜(1.51.50.21.51.50.2厘米为宜)厘米为宜)厘米
6、为宜)厘米为宜)n n3.3.合理选择固定液(免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓合理选择固定液(免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓合理选择固定液(免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓合理选择固定液(免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛;我病理科大标本一般选择中性缓冲甲醛,它可以冲甲醛;我病理科大标本一般选择中性缓冲甲醛,它可以冲甲醛;我病理科大标本一般选择中性缓冲甲醛,它可以冲甲醛;我病理科大标本一般选择中性缓冲甲醛,它可以兼顾常规染色和免疫组化。小标本选用兼顾常规染色和免疫组化。小标本选用兼顾常规染色和免疫组化。小标本选用兼顾常规染色和免疫组化。小标本选用AAFAAF液)液)液)液)n n4.4.
7、固定液的量为组织固定液的量为组织固定液的量为组织固定液的量为组织5 5倍以上(最少也要没过组织)倍以上(最少也要没过组织)倍以上(最少也要没过组织)倍以上(最少也要没过组织)n n5.5.固定时间得当:大标本(固定时间得当:大标本(固定时间得当:大标本(固定时间得当:大标本(6-12H6-12H)小标本()小标本()小标本()小标本(3-6H3-6H),时间),时间),时间),时间太短,影响组织固定的效果,对以后一系列的处理都有影太短,影响组织固定的效果,对以后一系列的处理都有影太短,影响组织固定的效果,对以后一系列的处理都有影太短,影响组织固定的效果,对以后一系列的处理都有影响,切片质量难以
8、保证。组织长时间的固定,福尔马林会响,切片质量难以保证。组织长时间的固定,福尔马林会响,切片质量难以保证。组织长时间的固定,福尔马林会响,切片质量难以保证。组织长时间的固定,福尔马林会产生一种酸,影响核的染色。另外,长时间的固定往往会产生一种酸,影响核的染色。另外,长时间的固定往往会产生一种酸,影响核的染色。另外,长时间的固定往往会产生一种酸,影响核的染色。另外,长时间的固定往往会出现福尔马林色素,尤其是造血器官的标本,更应注意。出现福尔马林色素,尤其是造血器官的标本,更应注意。出现福尔马林色素,尤其是造血器官的标本,更应注意。出现福尔马林色素,尤其是造血器官的标本,更应注意。固定时间过长,可
9、降低抗原的活性,影响组化。固定时间过长,可降低抗原的活性,影响组化。固定时间过长,可降低抗原的活性,影响组化。固定时间过长,可降低抗原的活性,影响组化。n微小破碎组织,在包埋操作时易于识别操微小破碎组织,在包埋操作时易于识别操n作,组织处理前可浸泡在作,组织处理前可浸泡在1%1%伊红液中伊红液中5-105-10分钟。伊红的粉红色在组织处理时可以保分钟。伊红的粉红色在组织处理时可以保留,但是在随后的切片染色中可以洗去不留,但是在随后的切片染色中可以洗去不影响正常的染色。影响正常的染色。常用固定液的介绍和配制常用固定液的介绍和配制 n n1.10中性缓冲福尔马林中性缓冲福尔马林:n n甲醛甲醛10
10、0ml,无水磷酸氢二钠无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)13g磷酸二氢钠(磷酸二氢钠(NaH2PO4H2O)4.0g,蒸蒸馏水馏水900mln n特点:渗透力强,收缩小,对抗原保存较特点:渗透力强,收缩小,对抗原保存较好,此液固定效果比单纯好,此液固定效果比单纯10福尔马林要好。福尔马林要好。n n2.AAF液:液:95乙醇乙醇85ml,甲醛(浓),甲醛(浓)10ml,冰醋酸,冰醋酸5ml。n n特点:此液除有固定作用外,兼有脱水作特点:此液除有固定作用外,兼有脱水作用,因此,固定后可直接入用,因此,固定后可直接入95乙醇脱水。乙醇脱水。n n其他还有很多固定液,不一一介绍,有些其他还有很多固定
11、液,不一一介绍,有些液体混合后使用比单独使用效果更佳,作液体混合后使用比单独使用效果更佳,作用互补,真正达到固定的目的。用互补,真正达到固定的目的。二.水洗n n1.固定后必须水洗(固定后必须水洗(15-30min),流水冲流水冲洗最佳,特别是固定时间长的组织。洗最佳,特别是固定时间长的组织。n n2.水洗不彻底后果:福尔马林色素沉着、水洗不彻底后果:福尔马林色素沉着、脱片、染色不鲜艳、免疫组化标记中脱片、染色不鲜艳、免疫组化标记中抗原抗体结合力减弱等现象抗原抗体结合力减弱等现象三.脱水n n概念:利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利概念:利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利概念:利用脱水
12、剂将组织内的水分置换出来,以利概念:利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入。于有机溶剂的渗入。于有机溶剂的渗入。于有机溶剂的渗入。n n浓度与时间:脱水用的乙醇浓度一般从浓度与时间:脱水用的乙醇浓度一般从浓度与时间:脱水用的乙醇浓度一般从浓度与时间:脱水用的乙醇浓度一般从70707575开始,然后依次开始,然后依次开始,然后依次开始,然后依次80809595100100,即由低浓度,即由低浓度,即由低浓度,即由低浓度逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很逐步到高浓度。脱水的时间与组织大
13、小、厚薄有很大关系、组织厚大,脱水时间要长些;而小薄的组大关系、组织厚大,脱水时间要长些;而小薄的组大关系、组织厚大,脱水时间要长些;而小薄的组大关系、组织厚大,脱水时间要长些;而小薄的组织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些(如度乙醇中可以长些(如度乙醇中可以长些(如度乙醇中可以长些(如70708080),而在高浓度),而在高浓度),而在高浓度),而在高浓度乙醇中要短些,这是因为高浓度的乙醇渗透力不强,乙醇中要短些,这是因为高浓度的乙醇渗透
14、力不强,乙醇中要短些,这是因为高浓度的乙醇渗透力不强,乙醇中要短些,这是因为高浓度的乙醇渗透力不强,延长脱水时间无益,相反高浓度乙醇易使组织收缩、延长脱水时间无益,相反高浓度乙醇易使组织收缩、延长脱水时间无益,相反高浓度乙醇易使组织收缩、延长脱水时间无益,相反高浓度乙醇易使组织收缩、变脆,致使以后切片和观察困难。变脆,致使以后切片和观察困难。变脆,致使以后切片和观察困难。变脆,致使以后切片和观察困难。n n脱水剂的种类有很多种,如乙醇、丙酮、脱水剂的种类有很多种,如乙醇、丙酮、甲醇、异丙基醇等。甲醇、异丙基醇等。n n丙酮是透明无色易燃液体,易与水、乙醇丙酮是透明无色易燃液体,易与水、乙醇和大
15、多数有机溶液相混合。其脱水快,但和大多数有机溶液相混合。其脱水快,但渗透差,脱水时间长易引起组织扭曲和变渗透差,脱水时间长易引起组织扭曲和变形。丙酮用于脱水可以去除组织中的脂肪。形。丙酮用于脱水可以去除组织中的脂肪。另外,坚硬的组织也可以置入甘油乙醇混另外,坚硬的组织也可以置入甘油乙醇混合液中浸泡处理。合液中浸泡处理。组织脱水不足的补救组织脱水不足的补救n 组织脱水不足常影响后继的透明与浸蜡组织脱水不足常影响后继的透明与浸蜡,表现为含蜡组织块发软,制成蜡块后组织表现为含蜡组织块发软,制成蜡块后组织块与周边石蜡容易发生脱离,此种蜡块往块与周边石蜡容易发生脱离,此种蜡块往往难以切出组织薄片或即使强
16、行切出也会往难以切出组织薄片或即使强行切出也会出现组织挤压、破碎,影响病理诊断。出现组织挤压、破碎,影响病理诊断。图图1 1组织脱水不足所制蜡块组织脱水不足所制蜡块,切片镜下观察切片镜下观察,组织挤压、破碎组织挤压、破碎,核染色不清核染色不清 图图2 2 补救处理后补救处理后,组织平整、无破碎组织平整、无破碎,核染色清晰核染色清晰n n把蜡块放入把蜡块放入把蜡块放入把蜡块放入60606060度石蜡溶液中度石蜡溶液中度石蜡溶液中度石蜡溶液中,使组织周围石蜡完全使组织周围石蜡完全使组织周围石蜡完全使组织周围石蜡完全溶解溶解溶解溶解,(1),(1),(1),(1)保持组织块内石蜡成份处于溶融状态。保
17、持组织块内石蜡成份处于溶融状态。保持组织块内石蜡成份处于溶融状态。保持组织块内石蜡成份处于溶融状态。同时同时同时同时,在在在在75757575度水浴槽内先后放入盛有度水浴槽内先后放入盛有度水浴槽内先后放入盛有度水浴槽内先后放入盛有30 ml30 ml30 ml30 ml丙酮的丙酮的丙酮的丙酮的A A A A、B B B B 两组烧杯两组烧杯两组烧杯两组烧杯(50 ml(50 ml(50 ml(50 ml容积容积容积容积),),),),时间差约为时间差约为时间差约为时间差约为5 min,5 min,5 min,5 min,预预预预热丙酮。热丙酮。热丙酮。热丙酮。(2)(2)(2)(2)待待待待A
18、 A A A丙酮完全沸时丙酮完全沸时丙酮完全沸时丙酮完全沸时,放入组织块放入组织块放入组织块放入组织块,此此此此时丙酮内逐渐有白色糊状石蜡沉淀出现时丙酮内逐渐有白色糊状石蜡沉淀出现时丙酮内逐渐有白色糊状石蜡沉淀出现时丙酮内逐渐有白色糊状石蜡沉淀出现,组织块组织块组织块组织块有液泡冒出。有液泡冒出。有液泡冒出。有液泡冒出。(3)(3)(3)(3)当当当当B B B B丙酮完全沸时丙酮完全沸时丙酮完全沸时丙酮完全沸时,迅速将组织迅速将组织迅速将组织迅速将组织块从块从块从块从A A A A丙酮换入其中丙酮换入其中丙酮换入其中丙酮换入其中,处理处理处理处理10 min,10 min,10 min,10
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