第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导-PPT.pptx

第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导v当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时浆细胞恶变等免疫球蛋白病时,一般先以血清蛋白区带一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为初筛实验。初筛实验。v如果发现有异常球蛋白区带如果发现有异常球蛋白区带,继而进行免疫固定电泳、继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析与免疫免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析与免疫球蛋白分类鉴定。球蛋白分类鉴定。实验一实验一血清免疫固定电泳实验血清免疫固定电泳实验实验目得实验目得v本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习v通过实习通过实习,熟悉血清免疫固定电泳得实验过程及注熟悉血清免疫固定电泳得实验过程及注意事项意事项;掌握血清免疫固定电泳检测掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白得基本蛋白得基本原理与临床意义。原理与临床意义。实验原理实验原理v 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后,将固定剂与将固定剂与各型各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面得各自泳道上及其轻链抗血清加于凝胶表面得各自泳道上,经孵育经孵育让固定剂与抗血清在各自泳道对应得凝胶内渗透并扩散让固定剂与抗血清在各自泳道对应得凝胶内渗透并扩散,若若有对应抗原存在有对应抗原存在,则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗,去除未结合蛋白质去除未结合蛋白质,仅保仅保留贮存在凝胶内得抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳留贮存在凝胶内得抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道与抗原抗体沉淀区带被参考道与抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。根染色液着色。根据电泳移动距离分离出单克隆组分。据电泳移动距离分离出单克隆组分。试剂与器材试剂与器材vAcide Violet染色液染色液:用用1L 10%冰醋酸溶解冰醋酸溶解Acide Violet。v脱色液脱色液:用用1L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Citric Acid Destain。v清洗液清洗液:8L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。v电泳仪电泳仪:spife 3000全自动电泳仪。全自动电泳仪。Spife 3000全自动电泳仪全自动电泳仪操作步骤操作步骤v样本处理样本处理:用生理盐水将血清标本适当稀释后备用用生理盐水将血清标本适当稀释后备用,其中同一份血清其中同一份血清第一泳道样本稀释第一泳道样本稀释3倍倍,第二至第六泳道样本稀释第二至第六泳道样本稀释5倍。倍。v区带电泳区带电泳 上样上样 胶片准备胶片准备 电泳电泳v沉淀反应沉淀反应 加抗血清加抗血清洗涤、烘干洗涤、烘干着着 色色 结果分析结果分析 v对染色烘干后得胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白对染色烘干后得胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道分子量参考道,观察第二至第六泳道有无对应得特异性单观察第二至第六泳道有无对应得特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示所示,其中其中sp泳道为血清蛋泳道为血清蛋白参考道白参考道,由下至上分别为白蛋白、由下至上分别为白蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白。第球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为泳道分别为IgG、IgA、IgM、抗血清泳道。抗血清泳道。大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点注意事项注意事项v标本需取新鲜血清进行分析标本需取新鲜血清进行分析,为避免抗原过剩引起得带现象为避免抗原过剩引起得带现象,血清于加样前应先作适当稀释并混匀。血清于加样前应先作适当稀释并混匀。v总免疫球蛋白得水平总免疫球蛋白得水平20g/L稀释剂量加倍稀释剂量加倍,当总免疫球蛋白当总免疫球蛋白水平水平5g/L稀释剂量减半稀释剂量减半(除了除了ELP泳道泳道)。v某些样本某些样本(尤其就是含有冷球蛋白或冷凝胶尤其就是含有冷球蛋白或冷凝胶)冷藏或冰冻后冷藏或冰冻后,可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下点样问题。在这样情况下,加加25l液化剂于液化剂于75l血清中血清中,混匀混匀15s。然后按规定程序继续进行。然后按规定程序继续进行。v某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有得免疫固某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有得免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25l还原剂还原剂(1-巯基乙醇巯基乙醇)于于75l血清混匀并令其反应至血清混匀并令其反应至少少15min(至多至多3h)后按规定程序继续进行。后按规定程序继续进行。v在电泳之前在电泳之前,凝胶与电泳槽得贴合面充满电泳介质凝胶与电泳槽得贴合面充满电泳介质,并并确保两者之间无气泡。确保两者之间无气泡。v在抗血清加入血清加样孔后在抗血清加入血清加样孔后,确保血清与凝胶之间无气确保血清与凝胶之间无气泡。泡。v染色之前得胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤染色之前得胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤,以出去以出去游离得血清与抗血清成分游离得血清与抗血清成分,降低染色后凝胶得背景色。降低染色后凝胶得背景色。临床应用临床应用v本法可对各类本法可对各类Ig及其轻链进行分型及其轻链进行分型,最常用于临床最常用于临床常规常规M蛋白得分型与鉴定。通常用于单克隆蛋白得分型与鉴定。通常用于单克隆Ig增殖增殖病病,单克隆单克隆Ig病病,本周蛋白与游离轻链病、多组份单本周蛋白与游离轻链病、多组份单克隆克隆Ig病病,重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆隆Ig病得诊断与鉴别诊断。病得诊断与鉴别诊断。v免疫固定电泳得优点就是分辨率高、敏感度高、操免疫固定电泳得优点就是分辨率高、敏感度高、操作周期短作周期短(仅需数小时仅需数小时)、结果易于分析。、结果易于分析。思考题思考题v结合实验室得免疫固定电泳分析系统结合实验室得免疫固定电泳分析系统,简述血清简述血清免疫固定电泳得影响因素及其克服免疫固定电泳得影响因素及其克服得方法。得方法。温州医学院温州医学院 陶志华陶志华实验二实验二 血清血清IgG定量检测得可定量检测得可报告范围评价实验报告范围评价实验 v可报告范围指可以报告得所有结果范围可报告范围指可以报告得所有结果范围,包含两种类型得包含两种类型得范围范围,即分析测量范围与临床可报告范围。即分析测量范围与临床可报告范围。v分析测量范围指对没有进行任何预处理分析测量范围指对没有进行任何预处理(稀释稀释,浓缩等浓缩等)得得标本标本,分析方法能够直接测定出得待测物范围分析方法能够直接测定出得待测物范围,也就就是也就就是系统最终得输出值系统最终得输出值(活性或浓度活性或浓度)与被分析物得活性或浓与被分析物得活性或浓度成线性比例得范围度成线性比例得范围,它反映整个系统得输出特性。它反映整个系统得输出特性。概述概述v临床可报告范围临床可报告范围 就是指对临床诊断、治疗有意义得待测就是指对临床诊断、治疗有意义得待测物浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围物浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围,可将标本可将标本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内内,最后结果乘以稀释倍数。最后结果乘以稀释倍数。实验目得实验目得v掌握血清掌握血清IgG定量检测得可报告范围评价得原理与方定量检测得可报告范围评价得原理与方法学法学,了解血清了解血清IgG测定方法学得性能。测定方法学得性能。实验原理实验原理v由于抗原抗体反应得特殊性由于抗原抗体反应得特殊性,免疫学检测项目应使用多点免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线定标绘制标准曲线,在绘制得标准曲线上查阅结果。由于在绘制得标准曲线上查阅结果。由于计算机技术得发展计算机技术得发展,仪器可对反应响应呈不同表现得结果仪器可对反应响应呈不同表现得结果做适当得处理做适当得处理,直接以最终计量单位方式报告检验结果直接以最终计量单位方式报告检验结果,在在此情况下此情况下,评价患者结果可报告范围时评价患者结果可报告范围时,可不必再去评价响可不必再去评价响应结果得真实曲线状态应结果得真实曲线状态,只要将样品作不同程度得稀释或只要将样品作不同程度得稀释或配制后配制后,将预期值与实际检测值作比较将预期值与实际检测值作比较,绘制在坐标纸上应绘制在坐标纸上应呈一条通过原点、斜率为呈一条通过原点、斜率为1得直线。直线所达得限值即为得直线。直线所达得限值即为该方法得患者结果可报告范围。该方法得患者结果可报告范围。试剂与器材试剂与器材v选用与检测仪器相配套得试剂、校准品及其她选用与检测仪器相配套得试剂、校准品及其她辅助试剂辅助试剂v参考选用检测系统中血清参考选用检测系统中血清IgG得检测范围选择得检测范围选择低浓度标本与高浓度标本低浓度标本与高浓度标本操作步骤操作步骤v按标本操作规程做好项目校准、常规质控按标本操作规程做好项目校准、常规质控,保证检测系统保证检测系统处于良好状态。处于良好状态。v实验标本得配制实验标本得配制,将血清将血清IgG得高得高(H)与低与低(L)样品按样品按:5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配制混关系各自配制混合合,形成系列评价得实验样品。并计算各样品得预期值。形成系列评价得实验样品。并计算各样品得预期值。v将系列评价得实验样品上机检测将系列评价得实验样品上机检测,每标本重复检测每标本重复检测24次次,结果记录于下表。结果记录于下表。v依照稀释关系依照稀释关系,计算各实验样品得预期值。按实验要求计算各实验样品得预期值。按实验要求,每每个样品做个样品做6次重复测定次重复测定,得得6个实测值个实测值,它们与预期值形成它们与预期值形成6对数据。对数据。结果分析结果分析v观察结果有无明显得数据差异观察结果有无明显得数据差异,若有明显差异时若有明显差异时,应判断就应判断就是否为离群点。是否为离群点。v在坐标纸上在坐标纸上,以以X表示各样品得预期值表示各样品得预期值,以以Y表示各样品得实表示各样品得实测值测值,将实验结果点在图上。将实验结果点在图上。v若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势,用直线回归对数用直线回归对数据进行统计据进行统计,得直线回归方程得直线回归方程Y=bX+a,若若b在在0、971、03范围内范围内,a接近于接近于0,则可直接判断测定方法可报告范围在实则可直接判断测定方法可报告范围在实验已涉及浓度。验已涉及浓度。v若若b不在不在0、971、03范围内范围内,a较大较大,试着舍去某组数据试着舍去某组数据,另另作回归统计。若缩小分析范围后作回归统计。若缩小分析范围后,回归式有明显改善回归式有明显改善,若若b接接近于近于1,a趋于趋于0。此时。此时,缩小得分析范围可作为真实得可报告缩小得分析范围可作为真实得可报告范围。范围。注意事项注意事项v进行可报告范围实验评价得样品必须与真实标本尽可能进行可报告范围实验评价得样品必须与真实标本尽可能相似相似,也要与真实标本具有相同得基质状态。也要与真实标本具有相同得基质状态。v评价样品要评价样品要5个或以上系列浓度得实验样品个或以上系列浓度得实验样品,浓度范围遍浓度范围遍及整个预期可报告范围。最高浓度得样品应达到可报告及整个预期可报告范围。最高浓度得样品应达到可报告范围得上限。范围得上限。v若收不到低值样品若收不到低值样品,可收集高值样品可收集高值样品,经系列不同程度稀经系列不同程度稀释释,形成系列评价样品。形成系列评价样品。v一天内做完本实验一天内做完本实验,一般每个实验样品做一般每个实验样品做24次重复测定。次重复测定。综合所有结果作统计学处理。综合所有结果作统计学处理。v应仔细阅读试剂说明书应仔细阅读试剂说明书,某些检测项目不适宜用稀释方法某些检测项目不适宜用稀释方法获取系列浓度得临床新鲜血清标本获取系列浓度得临床新鲜血清标本,可采用商品质控物、可采用商品质控物、校准品等。校准品等。v 临床可报告范围得评价要对分析标本进行最大稀释度得评临床可报告范围得评价要对分析标本进行最大稀释度得评价实验价实验,以此作为临床可报告范围得上限以此作为临床可报告范围得上限;如果低限有临床如果低限有临床意义时意义时,可增加分析标本反应量来进行检测下限评价实验可增加分析标本反应量来进行检测下限评价实验,并以此作为临床可报告范围下限。并以此作为临床可报告范围下限。