第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导-PPT.pptx
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1、第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导v当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时浆细胞恶变等免疫球蛋白病时,一般先以血清蛋白区带一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为初筛实验。初筛实验。v如果发现有异常球蛋白区带如果发现有异常球蛋白区带,继而进行免疫固定电泳、继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析与免疫免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析与免疫球蛋白分类鉴定。球蛋白分类鉴定。实验一实验一血清免疫固定电泳实验血清免疫固定电
2、泳实验实验目得实验目得v本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习v通过实习通过实习,熟悉血清免疫固定电泳得实验过程及注熟悉血清免疫固定电泳得实验过程及注意事项意事项;掌握血清免疫固定电泳检测掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白得基本蛋白得基本原理与临床意义。原理与临床意义。实验原理实验原理v 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后,将固定剂与将固定剂与各型各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面得各自泳道上及其轻链抗血清加于凝胶表面得各自泳道上,经孵育经孵育让固定剂与抗血清在各自泳道对应得凝胶内渗透并扩散让固定剂与抗血清在各
3、自泳道对应得凝胶内渗透并扩散,若若有对应抗原存在有对应抗原存在,则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗,去除未结合蛋白质去除未结合蛋白质,仅保仅保留贮存在凝胶内得抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳留贮存在凝胶内得抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道与抗原抗体沉淀区带被参考道与抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。根染色液着色。根据电泳移动距离分离出单克隆组分。据电泳移动距离分离出单克隆组分。试剂与器材试剂与器材vAcide Violet染色液染色液:用用1L 10%冰醋酸溶解冰醋酸溶解
4、Acide Violet。v脱色液脱色液:用用1L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Citric Acid Destain。v清洗液清洗液:8L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。v电泳仪电泳仪:spife 3000全自动电泳仪。全自动电泳仪。Spife 3000全自动电泳仪全自动电泳仪操作步骤操作步骤v样本处理样本处理:用生理盐水将血清标本适当稀释后备用用生理盐水将血清标本适当稀释后备用,其中同一份血清其中同一份血清第一泳道样本稀释第一泳道样本稀释3倍倍,第二至第六泳道样本稀释第二至第六泳道样本稀释5倍。倍。v区带电泳区带电泳 上样上样 胶片准备胶片准备 电泳电泳v沉淀反应沉淀反
5、应 加抗血清加抗血清洗涤、烘干洗涤、烘干着着 色色 结果分析结果分析 v对染色烘干后得胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白对染色烘干后得胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道分子量参考道,观察第二至第六泳道有无对应得特异性单观察第二至第六泳道有无对应得特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示所示,其中其中sp泳道为血清蛋泳道为血清蛋白参考道白参考道,由下至上分别为白蛋白、由下至上分别为白蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白。第球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为泳道分别为IgG、IgA、IgM、抗血清泳道。抗血清泳道。大家有疑
6、问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点注意事项注意事项v标本需取新鲜血清进行分析标本需取新鲜血清进行分析,为避免抗原过剩引起得带现象为避免抗原过剩引起得带现象,血清于加样前应先作适当稀释并混匀。血清于加样前应先作适当稀释并混匀。v总免疫球蛋白得水平总免疫球蛋白得水平20g/L稀释剂量加倍稀释剂量加倍,当总免疫球蛋白当总免疫球蛋白水平水平5g/L稀释剂量减半稀释剂量减半(除了除了ELP泳道泳道)。v某些样本某些样本(尤其就是含有冷球蛋白或冷凝胶尤其就是含有冷球蛋白或冷凝胶)冷藏或冰冻
7、后冷藏或冰冻后,可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下点样问题。在这样情况下,加加25l液化剂于液化剂于75l血清中血清中,混匀混匀15s。然后按规定程序继续进行。然后按规定程序继续进行。v某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有得免疫固某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有得免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25l还原剂还原剂(1-巯基乙醇巯基乙醇)于于75l血清混匀并令其反应至血清混匀并令其反应至少少15min(至多至多3h)后按规定程序继续进行。后按规
8、定程序继续进行。v在电泳之前在电泳之前,凝胶与电泳槽得贴合面充满电泳介质凝胶与电泳槽得贴合面充满电泳介质,并并确保两者之间无气泡。确保两者之间无气泡。v在抗血清加入血清加样孔后在抗血清加入血清加样孔后,确保血清与凝胶之间无气确保血清与凝胶之间无气泡。泡。v染色之前得胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤染色之前得胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤,以出去以出去游离得血清与抗血清成分游离得血清与抗血清成分,降低染色后凝胶得背景色。降低染色后凝胶得背景色。临床应用临床应用v本法可对各类本法可对各类Ig及其轻链进行分型及其轻链进行分型,最常用于临床最常用于临床常规常规M蛋白得分型与鉴定。通常用于单克隆蛋白得分型
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