硕士高级免疫学实验技术-PPT.pptx

硕士高级免疫学实验技术实验原理实验原理实验分组、试剂与器材实验分组、试剂与器材试剂试剂:$封闭液封闭液封闭液封闭液(1%PBS-1%PBS-脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉)7)7mlml$洗液洗液洗液洗液(PBS-Tween20)1PBS-Tween20)1瓶瓶瓶瓶$抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体 mlml$酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-GaM)HRP-GaM)5ml 5ml$底物底物底物底物 5 5mlml$终止液终止液终止液终止液(H H2 2SOSO4 4)2 2、5ml5ml器材器材:$酶标板酶标板酶标板酶标板 1 1块块块块$200200 l pipette l pipette 1 1把把把把$1000 1000 l pipettel pipette1 1把把把把$Tip(Tip(大大大大/小小小小)若干若干若干若干$1 1、5ml EP5ml EP管管管管若干若干若干若干$培养箱培养箱培养箱培养箱43431 1个个个个$吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸若干若干若干若干四人一组四人一组,每人做一排每人做一排注意事项注意事项清点好实验物品清点好实验物品清点好实验物品清点好实验物品加样器得正确使用加样器得正确使用加样器得正确使用加样器得正确使用加样器头不能混用加样器头不能混用加样器头不能混用加样器头不能混用,尤其就是吸酶和底物尤其就是吸酶和底物尤其就是吸酶和底物尤其就是吸酶和底物底物应现用现配底物应现用现配底物应现用现配底物应现用现配1.1.包被包被包被包被:用用用用0 0、0505M PH9M PH9、6 6碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,OVA,1010 g/ml)g/ml)稀释。稀释。稀释。稀释。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中,4 over night,4 over night。2.2.封闭封闭封闭封闭:次日次日次日次日,弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入150 150 l/well l/well 1%PBS-1%PBS-脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉(封闭液封闭液封闭液封闭液),43 for 60mins43 for 60mins。3.3.加样加样加样加样:弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液,加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体100 100 l/l/孔孔孔孔,4343孵育孵育孵育孵育40mins40mins 。孵。孵。孵。孵育结束后育结束后育结束后育结束后,用用用用PBS-TPBS-T洗三次洗三次洗三次洗三次,每次每次每次每次5 5minmin 。4.4.酶抗酶抗酶抗酶抗:酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-HRP-羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠IgG),100IgG),100 l/well l/well,置置置置4343孵育孵育孵育孵育40mins,40mins,用用用用PBS-TPBS-T洗洗洗洗三次三次三次三次,每次每次每次每次5 5minmin 。5.5.显色显色显色显色:于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液100100 l/well,l/well,室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。6.6.终止终止终止终止:加加加加50 50 l/welll/well2M2M硫酸硫酸硫酸硫酸(终止液终止液终止液终止液)。(altering the pH)(altering the pH)7.7.判定判定判定判定:肉眼观察肉眼观察肉眼观察肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔,相对应得抗相对应得抗相对应得抗相对应得抗体得稀释度倒数为该抗体得效价。体得稀释度倒数为该抗体得效价。体得稀释度倒数为该抗体得效价。体得稀释度倒数为该抗体得效价。酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量:4:490nm90nm滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值(A A),),与阴性对照相比其与阴性对照相比其与阴性对照相比其与阴性对照相比其A A值值值值2,2,相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。包被包被(coating)固相支持物固相支持物固相支持物固相支持物:聚聚聚聚苯苯苯苯乙乙乙乙烯烯烯烯和和和和聚聚聚聚氯氯氯氯乙乙乙乙烯烯烯烯有有有有较较较较强强强强得得得得非非非非特特特特异异异异性性性性物物物物理理理理吸吸吸吸附附附附蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质得得得得特特特特性性性性,被吸附得蛋白质得免疫学活性不发生改变被吸附得蛋白质得免疫学活性不发生改变被吸附得蛋白质得免疫学活性不发生改变被吸附得蛋白质得免疫学活性不发生改变(Ag-AbAg-AbAg-AbAg-Ab结合结合结合结合)。包被缓冲液包被缓冲液包被缓冲液包被缓冲液:碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(pHpH9 9、6 6)磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pHpH7 7、2 2)Tris-HCLTris-HCL缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液(pHpH7-87-8)包被温度、时间包被温度、时间包被温度、时间包被温度、时间:4 4 18-2418-24小时小时小时小时包被抗原量包被抗原量包被抗原量包被抗原量:1010 g/mlg/ml1.1.包被包被包被包被:用用用用0 0、0505M PH9M PH9、6 6碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,OVA,1010 g/ml)g/ml)稀释。稀释。稀释。稀释。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中,4 over night,4 over night。2.2.封闭封闭封闭封闭:次日次日次日次日,弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入150 150 l/well 1%PBS-l/well 1%PBS-脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉(封闭液封闭液封闭液封闭液),43,43 for 60minsfor 60mins。3.3.加样加样加样加样:弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液,加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体100 100 l/l/孔孔孔孔。4343孵育孵育孵育孵育40mins40mins。孵孵孵孵育结束后育结束后育结束后育结束后,用用用用PBS-TPBS-T洗三次洗三次洗三次洗三次,每次每次每次每次5 5minmin 。4.4.酶抗酶抗酶抗酶抗:酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-HRP-羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠IgG),100IgG),100 l/well l/well,置置置置4343孵育孵育孵育孵育40mins,40mins,用用用用PBS-TPBS-T洗三洗三洗三洗三次次次次,每次每次每次每次5 5minmin 。5.5.显色显色显色显色:于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液100100 l/well,l/well,室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。6.6.终止终止终止终止:加加加加50 50 l/welll/well2M2M硫酸硫酸硫酸硫酸(终止液终止液终止液终止液)。(altering the pH)(altering the pH)7.7.判定判定判定判定:肉眼观察肉眼观察肉眼观察肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔,相对应得抗体得相对应得抗体得相对应得抗体得相对应得抗体得稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量:4:490nm90nm滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值(A A),),与阴性与阴性与阴性与阴性对照相比其对照相比其对照相比其对照相比其A A值值值值2,2,相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。封闭封闭(blocking)高浓度得无关蛋白质高浓度得无关蛋白质 包包被被时时所所用用得得抗抗原原或或抗抗体体浓浓度度较较低低,吸吸收收后后固固相相载载体体表表面面尚尚有有未未被被占占据据得得空空隙隙,封封闭闭就就就就是是让让大大量量不不相相关关得得蛋蛋白白质质充充填填这这些些空空隙隙,从从而而排排斥斥在在ELISAELISA其后得步骤中干扰物质得再吸附。见图其后得步骤中干扰物质得再吸附。见图:EEEEEECoatingBlockingAfter blockingAfter blockingWithout blockingEffect of BlockingEffect of Blocking最常用得封闭剂最常用得封闭剂:0、5%-1%得牛血清白蛋白得牛血清白蛋白(BSA)10%得小牛血清得小牛血清1%明胶明胶洗液洗液(磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液,PBS-T)磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液:(PBS)吐温吐温20(Tween 20):抑制蛋白质吸附于塑料表面得非离子型表面活性剂抑制蛋白质吸附于塑料表面得非离子型表面活性剂抑制非特异性吸附抑制非特异性吸附大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点1.1.包被包被包被包被:用用用用0 0、0505M PH9M PH9、6 6碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,OVA,1010 g/ml)g/ml)稀释。稀释。稀释。稀释。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中,4 over night,4 over night。2.2.封闭封闭封闭封闭:次日次日次日次日,弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入150 150 l/well l/well 1%PBS-1%PBS-脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉(封闭液封闭液封闭液封闭液),43 for 60min43 for 60min。3.3.加样加样加样加样:弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液,加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体100 100 l/l/孔孔孔孔,(稀释与加板方法稀释与加板方法稀释与加板方法稀释与加板方法)。4343孵育孵育孵育孵育40mins40mins。孵育结束后孵育结束后孵育结束后孵育结束后,用用用用PBS-TPBS-T洗三次洗三次洗三次洗三次,每次每次每次每次5 5minmin 。4.4.酶抗酶抗酶抗酶抗:酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-HRP-羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠IgG),100IgG),100 l/well l/well,置置置置4343孵育孵育孵育孵育40mins,40mins,用用用用PBS-TPBS-T洗三洗三洗三洗三次次次次,每次每次每次每次5 5minmin 。5.5.显色显色显色显色:于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液100100 l/well,l/well,室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。6.6.终止终止终止终止:加加加加50 50 l/welll/well2M2M硫酸硫酸硫酸硫酸(终止液终止液终止液终止液)。(altering the pH)(altering the pH)7.7.判定判定判定判定:肉眼观察肉眼观察肉眼观察肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔,相对应得抗体得相对应得抗体得相对应得抗体得相对应得抗体得稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。稀释度倒数为该抗体得效价。酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量:4:490nm90nm滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值(A A),),与阴性与阴性与阴性与阴性对照相比其对照相比其对照相比其对照相比其A A值值值值2,2,相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。样品得稀释样品得稀释抗抗OVA抗体抗体(样品样品)得稀释方法得稀释方法抗体原液稀释度就是抗体原液稀释度就是1:40女女120 lPBS-T120 l抗抗OVA抗体抗体(1:40)120ul1:1601:3201:6401:25601:12801:80加板方法加板方法1:3201:640Ab-Ab-Ag-Ag-1:401:12801:401:801:1601:2560Ag-Ag-Ab-Ab-1.1.包被包被包被包被:用用用用0 0、0505M PH9M PH9、6 6碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,OVA,1010 g/ml)g/ml)稀释。稀释。稀释。稀释。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中,4 over night,4 over night。2.2.封闭封闭封闭封闭:次日次日次日次日,弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入150 150 l/well l/well 1%PBS-1%PBS-脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉脱脂奶粉(封闭液封闭液封闭液封闭液),43 for 60mins43 for 60mins。3.3.加样加样加样加样:弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液,加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体100 100 l/l/孔孔孔孔,4343孵育孵育孵育孵育40mins40mins。孵育结束后孵育结束后孵育结束后孵育结束后,用用用用PBS-TPBS-T洗三次洗三次洗三次洗三次,每次每次每次每次5 5minmin 。4.4.酶抗酶抗酶抗酶抗:酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-HRP-羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠IgG),100IgG),100 l/well l/well,置置置置4343孵育孵育孵育孵育40mins,40mins,用用用用PBS-TPBS-T洗洗洗洗三次三次三次三次,每次每次每次每次5 5minmin 。5.5.显色显色显色显色:于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液100100 l/well,l/well,室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。6.6.终止终止终止终止:加加加加50 50 l/welll/well2M2M硫酸硫酸硫酸硫酸(终止液终止液终止液终止液)。(altering the pH)(altering the pH)7.7.判定判定判定判定:肉眼观察肉眼观察肉眼观察肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔,相对应得抗体相对应得抗体相对应得抗体相对应得抗体得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量:4:490nm90nm滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值(A A),),与与与与阴性对照相比其阴性对照相比其阴性对照相比其阴性对照相比其A A值值值值2,2,相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。Enzyme常用得酶常用得酶常用得酶常用得酶 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)(horseradish peroxidase,HRP)碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosohatase,AP)(alkaline phosohatase,AP)。葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。1.1.包被包被包被包被:用用用用0 0、0505M PH9M PH9、6 6碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,OVA,1010 g/ml)g/ml)稀释。稀释。稀释。稀释。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中加入聚苯乙烯酶标板中,4 over night,4 over night。2.2.封闭封闭封闭封闭:次日次日次日次日,弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入弃去孔内溶液。加入150 150 l/well l/well 1%BSA-PBS-T(1%BSA-PBS-T(封闭液封闭液封闭液封闭液),43,43 for 60minfor 60min。3.3.加样加样加样加样:弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液弃去封闭液,加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得加倍比稀释得抗抗抗抗OVAOVA抗体抗体抗体抗体100 100 l/l/孔孔孔孔,4343孵育孵育孵育孵育40mins40mins。孵育结。孵育结。孵育结。孵育结束后束后束后束后,用用用用PBS-TPBS-T洗三次洗三次洗三次洗三次,每次每次每次每次5 5minmin 。4.4.酶抗酶抗酶抗酶抗:酶标抗体酶标抗体酶标抗体酶标抗体(HRP-HRP-羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠羊抗鼠IgG),100IgG),100 l/well l/well,置置置置4343孵育孵育孵育孵育40mins,40mins,用用用用PBS-TPBS-T洗三洗三洗三洗三次次次次,每次每次每次每次5 5minmin 。5.5.显色显色显色显色:于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液于各反应孔中加入新鲜配制得底物溶液100100 l/well,l/well,室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。室温下避光显色。6.6.终止终止终止终止:加加加加50 50 l/welll/well2M2M硫酸硫酸硫酸硫酸(终止液终止液终止液终止液)。(altering the pH)(altering the pH)7.7.判判判判 定定定定:肉眼观察肉眼观察肉眼观察肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔与阴性对照孔相比有明显呈色反应得为阳性孔,相对应得抗体相对应得抗体相对应得抗体相对应得抗体得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。得稀释度倒数为该抗体得效价。酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量酶标仪测量:4:490nm90nm滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值滤光片下测光吸收值(A A),),与阴与阴与阴与阴性对照相比其性对照相比其性对照相比其性对照相比其A A值值值值2,2,相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。相对应得抗体稀释度为该抗体得效价。显色显色显色原理显色原理显色原理显色原理:HRPHRP催催催催化化化化过过过过氧氧氧氧化化化化物物物物得得得得氧氧氧氧化化化化反反反反应应应应,最最最最具具具具代代代代表表表表性性性性得得得得过过过过氧氧氧氧化化化化物物物物为为为为HH2 2OO2 2,其其其其反反反反应应应应式式式式如如如如下下下下:DHDH2 2+HH2 2OO2 2 D+D+HH2 2OO。上上上上式式式式中中中中,DHDH2 2为为为为供供供供氢氢氢氢体体体体,HH2 2OO2 2为为为为受受受受氢氢氢氢体体体体。在在在在ELISAELISA中中中中,DHDH2 2一一一一般般般般为为为为无无无无色色色色化化化化合合合合物物物物,经经经经酶酶酶酶作作作作用用用用后成为有色得产物后成为有色得产物后成为有色得产物后成为有色得产物,以便作比色测定。以便作比色测定。以便作比色测定。以便作比色测定。常用得供氢体常用得供氢体常用得供氢体常用得供氢体:邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺(O-phenylenediamine,(O-phenylenediamine,OPDOPD)四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMBTMB)ABTS2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)ABTS2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)OPD OPDOPD氧氧氧氧化化化化后后后后得得得得产产产产物物物物呈呈呈呈橙橙橙橙红红红红色色色色,用用用用酸酸酸酸终终终终止止止止酶酶酶酶反反反反应应应应后后后后,在在在在492nm492nm处处处处有有有有最最最最高高高高吸吸吸吸收收收收峰峰峰峰,灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高,比比比比色色色色方方方方便便便便,就就就就是是是是HRPHRP结合物最常用得底物。结合物最常用得底物。结合物最常用得底物。结合物最常用得底物。OPDOPD本本本本身身身身难难难难溶溶溶溶于于于于水水水水,OPD2HCLOPD2HCL为为为为水水水水溶溶溶溶性性性性。OPDOPD见见见见光光光光易易易易变变变变质质质质,与与与与过过过过氧氧氧氧化化化化氢氢氢氢混混混混合合合合成成成成底底底底物物物物应应应应用用用用液液液液后后后后更更更更不不不不稳稳稳稳定定定定,须须须须现现现现配置现用。配置现用。配置现用。配置现用。OPD OPD产物用硫酸终止后产物用硫酸终止后产物用硫酸终止后产物用硫酸终止后,显色由橙红色转向棕黄色。显色由橙红色转向棕黄色。显色由橙红色转向棕黄色。显色由橙红色转向棕黄色。TMBTMBTMB经经经经HRPHRP作作作作用用用用后后后后共共共共产产产产物物物物显显显显蓝蓝蓝蓝色色色色,目目目目视视视视对对对对比比比比鲜鲜鲜鲜明明明明。TMBTMB性性性性质质质质较较较较稳稳稳稳定定定定,可可可可配配配配成成成成溶溶溶溶液液液液试试试试剂剂剂剂,只只只只需需需需与与与与HH2 2OO2 2溶溶溶溶液液液液混混混混和和和和即即即即成成成成应应应应用用用用液液液液,可直接作底物使用。可直接作底物使用。可直接作底物使用。可直接作底物使用。TMBTMB又又又又有有有有无无无无致致致致癌癌癌癌性性性性等等等等优优优优点点点点,因因因因此此此此在在在在ELISAELISA中中中中应应应应用用用用日日日日趋趋趋趋广广广广泛泛泛泛。酶酶酶酶反反反反应应应应用用用用HCLHCL或或或或HH2 2SOSO4 4终终终终止止止止后后后后,TMBTMB产产产产物物物物由由由由蓝蓝蓝蓝色色色色呈呈呈呈黄黄黄黄色色色色,可可可可在比色计中定量在比色计中定量在比色计中定量在比色计中定量,最适吸收波长为最适吸收波长为最适吸收波长为最适吸收波长为405nm405nm。