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毛细管电泳技术在手性药物分析中的应用
摘要:
手性药物的分离近年来越来越引起世界各国的普遍关注。这是由于手性药物引入人体，其对映异构体由人体内的手性受体、酶及蛋白以两个完全不同的分子处理，各个对映异构体在生物环境中表现出药物效应的种类和强度不同以及药物吸收、分布、代谢、排泄等方面存在立体选择性差异。对映体的一个可能是有效成分，而另一个则可能是低效无效甚至有毒。因此，开发和研究有实际应用价值的手性对映体的拆分技术以用于医药质量控制具有重要的现实意义。气相色谱法（GC和高效液相色谱法(HPLC已成功用于许多对映体的拆分制备与纯度测定,而毛细管电泳（CE作为二十世纪80年代才逐渐兴起的一种分离分析技术已逐步在药物、生物大分子、临床医学等领域中得到了广泛的应用。由于CE分离效率高、分离模式多、低耗、快捷简便等优点,因而在手性分离中具有诸多优势,它与GC、HPLC相互补充,显示了巨大的应用潜力,有望成为分离分析手性化合物最为有效和最简便经济的方法.
手性拆分有直接拆分和间接拆分两种形式。直接拆分是指在手性环境下对对映体的直接分离；间接拆分是指先将对映体与手性光学试剂反应，生成非对映异构体之后再进行分离。
关键词:
毛细管电泳技术手性药物药物分析
1.前言：
毛细管电泳技术确实具备特点,其主要者有：( 1 因毛细管可有效散热而可施以高强度电场，C E的分离、分析是高效而快速的;( 2 样品用量极少,仅需条件u L至n L,耗用试剂量少;( 3 不用支持基质的FSCE 法可避免样品与基质的作用,有利于保持生物活性;( 4 与传统凝胶电泳相比，省略铸胶、染色、干燥等许多操作,实验效率大大提高,电泳系统构成了“一休化"的电泳仪；( 5 实现在线检测后重现性和定量粘度优于传统电泳，在某些方面可与HPLC互为补充，提供正交结果，甚至取而代之。正因为具备许多优点,CE获得了迅速的发展。有人誉之为电泳技术的“新纪元"。然而,应该说CE仍处于继续成长的阶段.例如：分离条件的标准化,能改善定量测定重现性的最佳进样方式，怎样使分析系统发展为制备系统，高灵敏检测手段的实用化，以及应用领域的继续扩展等等,均有待进一步解决。如果这些问题能逐步解决,则CE将如GC、HPLC等微量分析方法那样，成为一种可普遍推广的实用的常规分离和分析手段。国内对CE的研究和应用，已引起注意，但起步较晚。有些单位已引进或即将引进国外的仪器，似应加紧使用，并尽量扩大应用领域，积累经验.少数单位已着手自行制作，或购买国外部分部件自行装配实验系统开展工作,这是值得提倡的。须知国外许多大学实验室或研究所的CE先行者,都在自己制作的实验系长统上做出成果。如能充分利用引进的和自制的仪器，加上国内的科技工作者能通过适当的渠道和适当的形式加强交流，密切协作,深信我国的毛细管电泳技术必能迎头赶上，在这一新兴技术领域的国际舞台上占有一席之地。
药物的不同手性异构体往往具有不同的药效、毒性和药动学性质。制药的发展趋势是开发单一手性异构体药物,而目前多数药物为外消旋体混合物。同一药物的两种手性异构体,其理化性质几乎完全相同，这给手性药物的分离带来了很大困难。不过,手性分离可以借鉴HPLC手性分离的一些策略用手性试剂同药物反应产生非对映异构体而分离在流动相中引入手性添加剂造成手性环境进行分离用手性固定相进行分离。在CE中不用固定相，因此只能引用前两种方法，其中以CE底液中加入手性添加剂进行手性分离研究的较多。
总之,因其分离效率很高(理论塔板数可达百万，用于手性分离有广阔的前景。同HPLC 手性分离相比,它具有手性添加剂用量少、不用手性柱等特点。
2。 毛细管区带电泳(CZE及各类手性选择剂
CZE又称毛细管自由电泳,是CE中最基本最普遍的一种模式。各类手性选择剂加入缓冲液中可实现多种手性异构体的分离,且机理也各不相同.
2。1 环糊精类化合物及其衍生物
环糊精（cyclodextrin，CD及其衍生物是最重要的一类手性选择剂，CD是用CD酶处理淀粉得到的化合物,目前已分离出的六聚、七聚和八聚体分别称为:α—，β—，γ—CD.
组成CD的每个葡萄糖单元均含5个手性碳原子,因此对对映异构体有较好的选择性。手性选择剂CD是由多个吡喃葡萄糖单元以1,4—糖苷键首尾相连形成的环状低聚糖，其分子具有中空的圆台状结构,空腔内相对疏水，其促使对映体分离的基本原理是在它们之间形成包合物。而不同包合物的稳定常数不同，从而导致分离包合物的稳定性主要决定于对映体分子的大小、极性与CD疏水空腔的匹配程度以及CD外缘的羟基与手性分子形成氢键的作用力的大小。
在3种天然的α-,β-，γ-CD中,β—CD的应用最为广泛。可能是由于其空腔与大部分对映体相匹配，而且β-CD易获得。当CD外缘的羟基衍生化后，可以增大其水溶性，且空腔尺寸与物化性质也有所改变。衍生化后若CD外缘带有不同取代基,则手性选择性增强;若衍生化取代基带电荷，则产生的静电作用也可使手性识别能力有所增强。
韦寿莲等在以氧氟沙星、扑尔敏、特布它林和普萘洛尔为手性药物,分别采用羟丙基-β环糊精(HP-β-CD 、羟丙基—β- 环糊精结合羧甲基—β- 环糊精（HP-β—CD/CM—β-CD作手性拆分试剂，考察环糊精浓度和pH对手性选择性的影响.结果发现环糊精提供手性相互作用,而pH强烈地影响这种相互作用。
2.2 冠醚
冠醚是另一类能形成主客体配合物的拆分剂，其手性拆分主要是基于冠醚环上处于不同位置的羟基与手性对映体（主要是胺类化合物存在氢键作用所致。对于无紫外吸收的伯胺类手性化合物可用手性冠醚作添加剂直接进行分离后,再用间接UV 检测方法检测,无须衍生。冠醚不但能溶于亲水性溶剂，也能溶于疏水性溶剂如苯、氯仿等，因而可将其作为非水CE的手性选择剂用于手性分离.
2.3 蛋白质
生物蛋白分子与药物分子相互作用的立体选择性一直深受人们的重视。蛋白质已成功用于CE手性分离。可作手性选择剂的蛋白质有：牛血清蛋白(BSA、人血清蛋白(HAS、卵粘蛋白、纤维素酶、伴清蛋白、α-酸性粘蛋白等。蛋白质作为手性选择剂易产生两个问题： （1蛋白质本身的紫外吸收将引入背景吸收值，从而影响检测灵敏度.解决方法:管壁吸附可通过管壁涂层、加入添加剂和采用高强场等方法解决。紫外吸收可于280 nm下检测来改善。（2重现性差。余丽宁等用人血清白蛋白分离了马来酸曲美布汀对映体。采用柱涂层技术可降低蛋白质在毛细管壁上的吸附，使峰形和分离重现性得到明显改善。在以蛋白质为手
性选择剂的对映体分离中通过加入有机添加剂,调节对映体与蛋白质间的疏水作用,可提高手性分离的选择性，并改善峰形。另外，除上述将蛋白质作为选择剂加入到缓冲液中,还可将其键合到凝胶、硅胶或CD上用于手性分离,作手性选择剂的最大缺点是重现性差。近来人们探索将蛋白质键合到7 Lm的硅胶上,在此条件下分离了安息香类镇定剂和去甲羟基安定。用纤维素酶进行手性拆分的研究报道较少,尚处于探索阶段,也有将其填充到毛细管柱内以电色谱形式进行手性分离.
2。4 大环抗生素
大环大分子抗生素是近年来运用并发展起来的一种非常有效的新型手性选择剂。抗生素具有手性大环状结构,与对映体可产生氢键、静电、疏水包合等作用从而实现手性分离。大环抗生素或多或少都具有紫外吸收，为避免其对检测的影响,通常使用浓度都在5nmol/L以下。新霉素属于氨基糖苷类抗生素，它是由新霉素B和新霉素C（质量比85︰15组成的混合物,由于新霉素具有易溶于水、紫外吸收低等优点，因此作为手性选择剂分离手性化合物具有很大的潜力。
2。5 多糖类化合物
对多糖类化合物用作CE手性选择剂进行研究，得出缓冲液的pH与手性选择剂的浓度是影响拆分的主要因素.麦芽糖糊精是常用的手性选择剂,它是D-葡萄糖以1，4—糖苷键相联接的线形低聚糖。离子型粘多糖选择剂有肝素、硫酸软骨素、硫酸右旋糖苷等，对于离子型溶质，肝素是首选的手性选择剂.
2。6 离子络合物
将金属离子Cu、Ni、Zn等离子和手性氨基酸形成三元金属离子络合物作为手性选择剂,对映体与此络合物中的一个手性氨基酸进行配体交换形成新络合物从而实现分离。此法常用于拆分氨基酸对映体、拟交感神经等药物的分离。利用手性选择性金属络合物对于单一的异构体分离,简单方便,并且有良好的分离效果.但用于分离不同种类异构体的混合物时，分析的效果显得不够理想.
3. 非水毛细管电泳(NACE
非水毛细管电泳（NACE是近几年才发展起来的毛细管电泳的一个分支，由于它有优于传统水相毛细管电泳的许多特点,因此广泛的应用于手性化合物的分离分析工作中。由于有机溶剂与水的物理、化学性质的不同,导致分离条件和分离机理的改变,因此对NACE分离机理的研究是十分有必要的。在非水毛细管电泳中,有两种策略可以实现手性的分离。一是手性消除.即让对映异构体与手性试剂进行化学反应,可以使之转变成非对应异构体.二
是构建手性分离环境,就是将手性分析物加到毛细管电泳的缓冲溶液中就可以构建出不同的手性环境。后一种方法高效快速,富于变化，并且不伤害样品。已经被普遍采用。手性环境的构建通常有三种方法:1。使用手性添加剂；2.使用手性填充毛细管;3.使用手性涂层毛细管。由于手性填充和手性涂层毛细管需要特别的制作技术,执行起来有一定的难度,而添加剂法只需要向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，经过一定的分离条件优化即能实现手性分离,是一种简单实用的方法。目前对NACE 还仅仅是停留在摸索应用的阶段，对其具体的分离机理的研究还很少，开发前景较大。
4.小结
手性药物的生物活性与其立体构型密切相关.目前新药研究的一个发展趋势是研制和生产光学纯的药物。手性药物的研究已成为国际新药研究的新方向之一,手性药物分析在手性药物研究中作用越来越重要,已成为国际上分析科学中的热点和难点。目前在手性药物分析中主要采用间接分析和直接分析.直接分析简便、快速、准确和可靠，其中HPLC法如今占主导地位，毛细管电泳法呈上升趋势。毛细管电泳是近20年来迅速发展起来的一种高效、快速、微量的分离分析方法。在毛细管电泳手性分析中,一般是将手性选择剂（又称手性添加剂加入到分离缓冲液中，提供一个手性环境,由于一对对映体与手性选择剂的作用强弱有差异,导致各自不同的电泳淌度，从而达到手性分离.
CE在手性拆分中具有明显的优势,由于样品用量小、分离效率高、分离速度快、灵敏度高等优点，在手性药物分离分析中日益受到人们的关注。随着技术的发展和各种手性选择剂的不断开发，手性分离技术的不断完善,CE在手性药物的拆分、手性对映体的鉴别、药物光学杂质的测定、体内药物手性分析及定量分析方法研究等方面将具有更加广阔的发展前景。毛细管电泳目前基本靠重力进样,因此进样量不好控制,重现性、稳定性不好是CE的弱点.
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