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第九章第九章 血清学反应血清学反应 第一节第一节 概概 述述一一 血清学反应的概念及一般特点血清学反应的概念及一般特点 抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为主要存在于血清中，故称为血清学反应血清学反应。血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：特点是：5/23/20245/23/20242 2兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组（一）特异性和交叉性（一）特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定簇的组成、结构以及排列不同，所诱导产生的抗体也不同。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。5/23/20245/23/20243 3兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （二）结合的可逆性（二）结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60C或pH降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性，可进行免疫吸附层析，纯化抗原或抗体。5/23/20245/23/20244 4兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （三）最适比与带现象（三）最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体的结合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。5/23/20245/23/20245 5兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 5/23/20245/23/20246 6兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组n n比例不适合比例不适合不能完成第二步反应不能完成第二步反应 带现象带现象 5/23/20245/23/20247 7兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （四）反应的阶段性（四）反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应；第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。5/23/20245/23/20248 8兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （五）影响反应的因素（五）影响反应的因素1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释，才出现较强反应。5/23/20245/23/20249 9兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组2.温度 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置37C温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用的低温中放置过夜。3.酸碱度 血清学反应通常用pH68，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。5/23/20245/23/20241010兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组二二 血清学反应的类型和参与成分血清学反应的类型和参与成分(见课本表9-1)三三 血清学反应的应用方式和目的血清学反应的应用方式和目的 抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。5/23/20245/23/20241111兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （一）抗原与抗体的快速检测（一）抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。5/23/20245/23/20241212兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （二）生物活性物质的超微定量（二）生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。5/23/20245/23/20241313兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 （四）微生物的鉴定与分析（四）微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组分进行分析。（五）血型鉴定（五）血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、Coomb实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。5/23/20245/23/20241414兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组第二节第二节 沉淀试验沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验。可溶性抗原+免疫血清 出现沉淀现象(病毒等)（抗体）比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 无沉淀现象 容易过多 前带现象 0.85%NaCl5/23/20245/23/20241515兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 一一 液相沉淀试验液相沉淀试验 1环状沉淀试验环状沉淀试验 原理：小试管内，下层沉 淀素与上层沉淀原 在液界面应形成白 色沉淀环。用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验）2絮状沉淀试验絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。5/23/20245/23/20241616兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组二二二二 琼脂扩散试验琼脂扩散试验琼脂扩散试验琼脂扩散试验 琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成分扩散）和双扩散。根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。5/23/20245/23/20241717兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组1 1 单向单扩散单向单扩散 亦称亦称OudinOudin。将。将0.6%-1%0.6%-1%琼脂加热熔化后，加琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入小试管中，待凝固后加入0.5ml0.5ml抗原于其上，直立，抗原于其上，直立，置于置于3737 C C中，中，2-3h2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。5/23/20245/23/20241818兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 2 2 单向双扩散单向双扩散 亦称Oakley。基本作法同上，但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。3 3 双向单扩散双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用1：5-10倍稀释），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。5/23/20245/23/20241919兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 4 4 4 4双向琼脂扩散（琼扩）双向琼脂扩散（琼扩）双向琼脂扩散（琼扩）双向琼脂扩散（琼扩）此法系采用此法系采用1%1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在3737 C C湿箱中湿箱中24-72h24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成分出现一条沉淀带。一种抗原成分出现一条沉淀带。结果判断：结果判断：结果判断：结果判断：如两个相邻孔之间抗原如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合；抗相同，则沉淀带融合；抗原则不同，则互相交叉；原则不同，则互相交叉；部分相同则部分融合，部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉。另外不同部分则交叉。特点：特点：特点：特点：简便、敏感性低、耗时、应用最广简便、敏感性低、耗时、应用最广用途：用途：用途：用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。5/23/20245/23/20242020兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 三、三、三、三、免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳 琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，故起迁移率不同，因电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，故起迁移率不同，因而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。1 1微量免疫电泳微量免疫电泳微量免疫电泳微量免疫电泳 用用pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液（的巴比妥缓冲液（V VB B液）配成液）配成1%1%的琼脂液，制成凝的琼脂液，制成凝胶板。在凝胶板胶板。在凝胶板1/31/3处打孔处打孔2 2个，孔径个，孔径2-3mm2-3mm，两孔间距两孔间距10-12mm10-12mm。孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳45min-2h45min-2h。电泳完毕，电泳完毕，滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的IgIg纯纯度鉴定。度鉴定。5/23/20245/23/20242121兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 正常人血清蛋白的免疫图象正常人血清蛋白的免疫图象5/23/20245/23/20242222兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组2 2对流免疫电泳对流免疫电泳 试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进行电泳。泳动行电泳。泳动30-90min30-90min，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，为阳性反应。为阳性反应。结果判断结果判断：Ag Ag AbAb特点特点：反应时间短，敏感性提高：反应时间短，敏感性提高用用途途：定定性性，已已不不多多用用（水水貂貂阿阿留留申申病病，以以病病原原AgAg检检测测病病貂貂血血清中的抗体）清中的抗体）5/23/20245/23/20242323兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 3火箭电泳火箭电泳 将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火箭，故称火箭电泳。箭，故称火箭电泳。本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲液，接通电源，板端电压液，接通电源，板端电压4V/cm4V/cm，电流电流3mA/cm3mA/cm，电泳电泳2-2-10h10h。电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗原量的测定（先用已知抗原浓度测定制成曲线）。原量的测定（先用已知抗原浓度测定制成曲线）。5/23/20245/23/20242424兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组火箭电泳图为标本；为标准抗原5/23/20245/23/20242525兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 第三节第三节 凝集试验凝集试验 细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，这种试验称为凝集试验（Agglutiation test）。参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集实验有直接凝集试验和间接凝集试验两种。5/23/20245/23/20242626兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组基本原理基本原理：生理盐水生理盐水颗粒性抗原颗粒性抗原 +相应抗血清相应抗血清 抗原颗粒凝集抗原颗粒凝集 (细菌、红细胞细菌、红细胞)比例适合比例适合 凝集原凝集原 凝集素凝集素 过多过多 后带现象后带现象 （稀释血清）（稀释血清）一、直接凝集试验一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。5/23/20245/23/20242727兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 1 1玻片凝集试验玻片凝集试验 将已知的抗血清将已知的抗血清1-21-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。絮片状凝集，谓之阳性反应。特点特点：简单、快速：简单、快速 用途用途：定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门：定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫5/23/20245/23/20242828兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组2 2试管凝集试验试管凝集试验 是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列试管，将待检血清用试管，将待检血清用0.5%0.5%石炭酸生理盐水石炭酸生理盐水作作1010倍递进倍递进稀释，每管维持量为稀释，每管维持量为0.5ml0.5ml，一管不加血清作对照。每一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度的抗原管中加入一定浓度的抗原0.5ml0.5ml，混合均匀，在混合均匀，在3737 C C或或室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同的凝集程度记录为同的凝集程度记录为+（100%100%菌体凝集），菌体凝集），+（75%75%凝集），凝集），+（25%25%凝集）。凝集）。凡能与一定量抗原发生凡能与一定量抗原发生50%50%凝集（凝集（+）的血清最高）的血清最高稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，必须建立阴性、阳性血清对照管。必须建立阴性、阳性血清对照管。特点：特点：准确、耗时准确、耗时 用途：用途：诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价(定量定量)5/23/20245/23/20242929兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 二、二、间接凝集试验 基本原理：可溶性抗原+惰性载体（聚苯乙烯乳胶微粒、炭粒、绵羊红细胞等）抗原致敏载体 抗原致敏载体+相应免疫血清(抗体)电解质 被动载体凝集(间接乳胶凝集、间接炭素凝集、间接红细胞凝集等)5/23/20245/23/20243030兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组特点：敏感(在微量反应板中进行试验)、快速。用途：用已知抗原致敏的载体可检测血清中的特异抗体及其效价。若用已知免疫血清（Ab）致敏的红细胞，则可检测病毒等可溶性抗原称为反向间接血凝试验。5/23/20245/23/20243131兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 5/23/20245/23/20243232兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组（正向）间接凝集反应原理示意图（正向）间接凝集反应原理示意图 5/23/20245/23/20243333兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组（反向）间接凝集反应原理示意图（反向）间接凝集反应原理示意图 5/23/20245/23/20243434兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组间接凝集抑制反应原理示意图间接凝集抑制反应原理示意图A A：标本中含抗原标本中含抗原 B B：标本中不含抗原标本中不含抗原5/23/20245/23/20243535兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组三、抗球蛋白试验三、抗球蛋白试验 抗球蛋白试验系Coombs等首先创立，故又称Coombs试验。试验主要用于测定单价抗体（不完全抗体）。在正常凝集试验时，应用本法可提高其敏感度。单价抗体与颗粒抗原相结合，不出现可见的凝集反应，但该抗原表面决定簇已被单价抗体所封闭，不能与相应的完全抗体相结合而发生凝集现象，故谓之阻断试验。阻断试验特异性不高，故很少使用，现多用抗球蛋白试验。由于抗体本身就是一种良好的抗原，用该动物的正常免疫球蛋白免疫异种动物，可获得抗球蛋白的抗体。抗球蛋白的抗体与已吸附单价抗体的颗粒抗原相结合，即可发生凝集，其实质也是一种间接凝集。本法用于人Rh血型测定及布氏杆菌单价抗体的检测。5/23/20245/23/20243636兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组第四节第四节 与补体有关的试验与补体有关的试验 一、补体的性质一、补体的性质一、补体的性质一、补体的性质 补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。5/23/20245/23/20243737兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组 二、溶解试验二、溶解试验1.1.溶血试验溶血试验溶血试验溶血试验 红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），以作补体结合反应的指示系统。以作补体结合反应的指示系统。吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。易保存，限制了本法的应用。5/23/20245/23/20243838兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组2.溶菌试验溶菌试验 某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称为溶菌反应或杀菌反应。本试验的测定可用比浊法。也可用菌落计数法；。本法敏感性高，但细菌抗原容易被溶解，且操作时间较长。5/23/20245/23/20243939兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组三补体参与的试验补体结合试验1 1参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。2 2反应原理：（如下图所示）。反应原理：（如下图所示）。3 3特点：敏感性特异性高。特点：敏感性特异性高。正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素效价、补体效价、抗原效价）。效价、补体效价、抗原效价）。4 4用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、马传贫、鼻疽等的检疫马传贫、鼻疽等的检疫。5/23/20245/23/20244040兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组5/23/20245/23/20244141兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组中和试验中和试验（病毒、毒素中和试验）（病毒、毒素中和试验）原理原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易 感动物、鸡或鸡胚、细胞的活性。感动物、鸡或鸡胚、细胞的活性。例例例例1 1 1 1 NDVNDV 9 911d11d鸡胚鸡胚 242448h 48h 鸡胚死亡鸡胚死亡NDVNDV+抗血清抗血清 9 911d11d鸡胚鸡胚 鸡胚不死亡鸡胚不死亡 第四节第四节 中和试验中和试验5/23/20245/23/20244242兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组例例2 2 口蹄疫病毒口蹄疫病毒(FMDV)4(FMDV)47d7d乳鼠乳鼠 乳鼠死亡乳鼠死亡 FMDV+FMDV+抗血清抗血清 4 47d7d乳鼠乳鼠 乳鼠不死亡乳鼠不死亡 用途：用途：1.1.用已知血清鉴定病毒用已知血清鉴定病毒诊断病毒病诊断病毒病2.2.用已知病毒检测血清抗体用已知病毒检测血清抗体诊断病毒感染，测定病毒诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）。免疫血清效价（中和价）。5/23/20245/23/20244343兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组第六节第六节 免疫标记技术免疫标记技术 免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分子或原子，联结在抗体或抗原上，利用抗体（或抗原）能与相应的抗原（或抗体）结合的特性，从而检测抗原或抗体的存在及所在部位（定位）。免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新技术。这项技术大大开拓了免疫学的应用范畴，使血清学反应进入了一个新的天地。它不仅可以用于抗原抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应用，亦可应用于生物领域其他方面。5/23/20245/23/20244444兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术）免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原所在的部位（定位）。原理：原理：荧光素（荧光素（F F）+AbAb AbAbF(FITCF(FITC）)AbAbF F +Ag Ag-+Ag Ag-AbAbF F 紫外光紫外光 Ag-Ag-AbAbF F 用途：用途：用用AbAbF F检测抗原检测抗原 （定性、定位）（定性、定位）特点：特点：敏感，需荧光显微镜敏感，需荧光显微镜5/23/20245/23/20244545兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组方法：方法：直接法直接法 间接法间接法 F F F F Ag Ag AgAg比较：检测一种抗原 标记一种动物的 就须标记特异 球蛋白AbF，就能 的一种AbF 检测多种抗原 较特异 较敏感 5/23/20245/23/20244646兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组2.2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）（1 1）间接法间接法 （2 2）双抗体夹心法）双抗体夹心法原理原理：用途用途：已知抗原、酶标：已知抗原、酶标 已知血清抗体、酶已知血清抗体、酶 抗体测血清抗体抗体测血清抗体 标抗体测抗原标抗体测抗原5/23/20245/23/20244747兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组3.3.放射免疫测定法放射免疫测定法原理原理：Ag+AbAg+AbR R Ag-Ag-AbAbR R 或或 AgAgR R+Ab+Ab AgAgR R-Ab-Ab 用液相闪烁仪用液相闪烁仪测测R R放出的射线量放出的射线量特点特点：敏感性极高，需高级闪烁仪：敏感性极高，需高级闪烁仪 同位素对人有放射性危害同位素对人有放射性危害用途用途：用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定：用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定5/23/20245/23/20244848兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组四、其他免疫标记技术四、其他免疫标记技术（一）免疫电镜技术（一）免疫电镜技术 将免疫学技术与电镜技术结合起来，发展成一种血清学反应超微技术，应用于抗原或抗体的定位，达到亚细胞水平。（二）生物素（二）生物素-亲和素标记技术亲和素标记技术 生物素即维生素H，在动物体内广泛存在，以蛋白、肝、肾等组织中的含量为最高。亲和素又称抗生物素，对生物素有较强的亲和力，结合常数高。近年来，利用生物素与亲和素结合，成为一种生物素-亲和素系统。5/23/20245/23/20244949兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组（三）核酸探针技术（三）核酸探针技术 微生物的遗传物质就是DNA。核苷酸是由磷酸、核糖和碱基组成的，而多核苷酸则是由若干个核苷酸连接成的一个大的聚合物。核酸探针具有检测的灵敏度高，特异性强，是按碱基配对和核酸碱基顺序进行的；使用方便，不需特殊仪器等特点。核酸探针可用于鉴定病毒、细菌以及某些真核细胞。对那些不易分离培养的病毒可以直接鉴定。5/23/20245/23/20245050兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组第七节第七节 葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白及其应用蛋白及其应用 葡萄球菌A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上所含的一种成分，具有多种生物学特性，能与人及多种哺乳动物的IgG的Fc段呈非特异性结合，结合后仍保持其抗体活性。同时与酶、荧光颜料偶联，因而应用于免疫领域。5/23/20245/23/20245151兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组一、葡萄球菌一、葡萄球菌A A蛋白的主要特性蛋白的主要特性 葡萄球菌A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种成分，存在于细菌表面，胞膜中含量很少。金色葡萄球菌的Cowan株葡萄球菌含大量A蛋白。等电点pH5.1，对热稳定，经1001h后仍保持与IgG结合的活性。葡萄球菌A蛋白可以与人及多种哺乳动物（如猪、兔、小白鼠）的IgG结合，并在琼脂中形成沉淀线。葡萄球菌A蛋白能与人的IgG1、IgG2、IgG4及猪的IgG等结合，形成复合物。这种结合是一种假免疫反应，是一种与IgG Fc段非特异的化学结合，结合后能激活补体，亦仍保持Fab的免疫活性。这一活性，已应用于免疫学领域中。5/23/20245/23/20245252兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组二、二、葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白在免疫学上的应用蛋白在免疫学上的应用（一）协同凝集试验（一）协同凝集试验 细胞壁上葡萄球菌A蛋白与抗体结合，被覆着特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可使互相联结引起协同凝集反应。这种方法应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。试验方法常采用玻片法，也可采用试管凝集法，每种方法均应设不含葡萄球菌A蛋白的阴性菌液对照。5/23/20245/23/20245353兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组（二）标记葡萄球菌（二）标记葡萄球菌A A蛋白技术蛋白技术 从富含葡萄球菌A蛋白的菌株中，提取葡萄球菌A成分，用酶、荧光染料标记，代替标记第二抗体，用于检测抗体或抗原。此法可避免制造第二抗体的麻烦，保存期长，因而广泛应用于实验室诊断中。end5/23/20245/23/20245454兽医微生物学及免疫学课程组兽医微生物学及免疫学课程组