基于多重PCR-LDR技术建立近交系大鼠单核苷酸多态性遗传检测方案.pdf
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1、实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2023.073赵 莹,硕士,副研究员。上海实验动物研究中心应用技术部副部长,承担上海市实验动物资源共享服务平台管理工作,同时担任实验动物与比较医学青年编委。主要从事实验动物(大鼠、小鼠、小型猪)种质资源保存、种群群体遗传质控研究、出生缺陷等动物模型研发及机制研究;多年从事动物实验设施管理、实验动物福利伦理等工作,熟悉GLP及AAALAC管理体系。主持完成“利用PCR-LDR基因分型技术构建小鼠特异染色体
2、替换系群”“大鼠骨癌痛模型筛选评价及中药干预作用”“野生来源1号染色体同源导入近交系C57BL6/J的研究与应用”“常用近交系及染色体替换小鼠遗传鉴定方案构建的研究”“1号染色体替换系小鼠高血脂模型的建立与研究”等多项省部级科研项目,参与省部级科研项目、地方科研项目和推荐性国家标准计划各1项。发表论文25篇,其中近3年以第一或共一作者身份在Cell Discovery、EMBO Molecular Medicine等期刊发表SCI论文2篇,累计影响影子达46;获得专利2项。基于多重PCR-LDR技术建立近交系大鼠单核苷酸多态性遗传检测方案赵丽亚1,2,倪丽菊1,张彩勤3,汤建平1,2,姚养正4
3、,聂艳艳1,顾晓雪2,赵莹1(1.上海实验动物研究中心,上海 201203;2.上海必凯科翼生物科技有限公司,上海 201203;3.空军军医大学实验动物中心,西安 710038;4.陕西省中医药研究院,西安 710003)摘要 目的建立一套基于多重PCR-连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)技术的近交系大鼠单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)检测方案。方法在5个品系的SPF级近交系大鼠120号常染色体和X染色体上共选取40个大鼠SNP位点,将SNP位点随机分为4组,构建基于多重PCR-LDR技术的近交
4、系大鼠4组SNP位点基因检测方案。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系。最后,通过第三方实验室对不同DNA聚合酶的扩增效果进行比对,验证本方案的可行性。结果用所构建的近交系大鼠SNP遗传检测方案测试5个大鼠品系时,各样本的所有位点均得到了良好的扩增结果。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系时也得到了良好的扩增结果,40个SNP位点在每个近交系大鼠中均为纯合。用3种来源不同的DNA聚合酶同时检测相同大鼠DNA样本的结果显示,Multiplex PCR Kit、AmpliTaq Gold 360 DNA聚合酶、Platinum Taq热启动DNA聚合酶在第13组SN
5、P位点均有扩增产物的电泳峰,其中Platinum Taq热启动DNA聚合酶在第4组SNP位点中少了一个扩增产物的电泳峰。另外,不同实验室间的比对结果显示,相同扩增体系的检测结果一致。结论基于多重PCR-LDR技术成功建立了一套覆盖所有常染色体与X染色体的大鼠SNP检测方案,该方法的稳定性和重复性俱佳。关键词 近交系大鼠;单核苷酸多态性;多重PCR-LDR;遗传检测;验证中图分类号 Q95-33 文献标志码 A 文章编号 1674-5817(2023)05-0548-11Establishing a Genetic Detection Protocol of Single Nucleotide
6、Polymorphisms Panels in Inbred Rats Based on Multiplex PCR-LDRZHAO Liya1,2,NI Liju1,ZHANG Caiqin3,TANG Jianping1,2,YAO Yangzheng4,NIE Yanyan1,GU Xiaoxue2,ZHAO Ying1(1.Shanghai Laboratory Animal Research Center,Shanghai 201203,China;2.Shanghai BK/KY Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 201203,China;3.Labo
7、ratory Animal Center of Air Force Medical University,Xian 710038,China;4.Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine,Xian 710003,China)Correspondence to:ZHAO Ying(ORCID:0000-0002-0551-0566),E-mail: 研究报告 Research Reports第一作者 赵丽亚(1981),女,硕士,工程师,研究方向:分子遗传学。E-mail:Z;倪丽菊(1979),女,硕士,副研究员,研究方向:实验动物遗传。E
8、-mail:通信作者 赵 莹(1982),女,硕士,副研究员,研究方向:实验动物遗传。E-mail:。ORCID:0000-0002-0551-0566ABSTRACT Objective To establish a set of single nucleotide polymorphisms(SNP)detection protocol for inbred rats based on multiplex PCR-ligase detection reaction(LDR).Methods A total of 40 rats SNP sites were selected on chro
9、mosomes 1-20 and X of rats among 5 inbred strains of rats,and the 40 SNP sites were randomly divided into four groups.A genetic detection protocol for 4 groups of SNP in inbred rats based on multiplex PCR-LDR technology was constructed.9 commonly used rat strains from two other domestic rat supplier
10、s were detected by this protocol.Finally,the feasibility of this protocol was verified by comparing the amplification effects of different DNA polymerases by a third-party laboratory.Results When using the constructed SNP detection protocol for inbred rats to test 5 rat strains,all sites in each sam
11、ple obtained good amplification results.The 9 commonly used rat strains from two other rat suppliers in china were also well amplified by this SNP detection protocol,and 40 SNPs were homozygous in each Inbred strain.The results of detection of the same rat DNA samples with three different DNA polyme
12、rases showed that the Multiplex PCR Kit,AmpliTaq Gold 360 DNA polymerase and Platinum II Taq hot start DNA polymerase had electrophoretic peaks of amplification products at all SNP sites in groups 1 to 3,and Platinum II Taq hot start DNA polymerase had one less electrophoretic peak of the amplificat
13、ion products at the SNP sites in group 4.In addition,inter-laboratory comparisons showed consistent results for the same amplification system.Conclusion Based on multiplex PCR-LDR technology,this study successfully established a SNP detection protocol for rats covering all autosomes and X chromosome
14、s with the excellent stability and repeatability.Key words Inbred rats;Single Nucleotide Polymorphisms;Multiplex PCR-LDR;Genetic detection;Verification生物医药研究离不开遗传质量稳定的实验动物。在构建动物模型、探索疾病发生机制、寻找药物靶点时,研究人员一般倾向于选择遗传背景一致的动物,以减少个体差异对实验结果的干扰,提高实验的重复性和精确性。但动物在传代过程中可能会由于引种不当、基因漂变、保种/繁殖等原因,导致遗传质量下降1。欧美等生物医药发达国
15、家早已将遗传质控列为实验动物资源保存的重要工作之一,投入大量经费开展遗传检测及种群质量控制研究,并由此支撑生命科学和生物医药产业的创新研究和发展2。近年来,我国的实验动物遗传质控工作也越来越受到国家重视,2023 年 7 月 1 日开始实施的新国家标准 GB 149232022实验动物 遗传质量控制3在近交系大鼠、小鼠遗传检测方法中,提供了近交系大鼠、小鼠可用短串联重复序列(short tandem repeats,STR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行遗传检测的指导原则,但并无近交系大鼠的SNP位点信息及具体检测方法。在众多的DN
16、A分子标记中,SNP标记由于具备共显性、标记丰富和良好的遗传稳定性而逐渐成为国内、国际通行的遗传检测方法4-7。本研究拟通过多重PCR-连接酶检测反应(ligase detective reaction,LDR)技术8建立一套覆盖所有常染色体与X染色体的大鼠SNP检测方案,并经过不同品牌DNA聚合酶、不同实验室的验证,确定一种兼具准确性、应用性与经济性的方案,以便推广应用。1材料与方法1.1主要试剂和仪器Multiplex PCR Kit(PM101-02,酶1)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,AmpliTaq GoldTM 360 DNA 聚合酶(4398896,酶 2)、POP7 胶(
17、4363929)、3730 Buffer(10)(4335613)和 Hi-DiTM Formamide(4311320)均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司,Platinum Taq热启动DNA聚合酶(14966001,酶3)购自美国Invitrogen公司,Taq DNA连接酶(M0208L)购自美国NEB公司,基因组DNA提取试剂盒(DP304)购自天根生物科技(北京)有限公司。PCR 仪(VeritiTM)、3730 DNA 分析仪(Applied BiosystemsTM)、超微量分光光度计(NanoDrop 1000)和台式高速冷冻大容量离心机(Leg
18、end RT)均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。1.2实验动物近交系大鼠 BN/BKl、F344/BKl、DA/BKl、PVG/548实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)ABSTRACT Objective To establish a set of single nucleotide polymorphisms(SNP)detection protocol for inbred rats based on multiplex PCR-ligase detection
19、reaction(LDR).Methods A total of 40 rats SNP sites were selected on chromosomes 1-20 and X of rats among 5 inbred strains of rats,and the 40 SNP sites were randomly divided into four groups.A genetic detection protocol for 4 groups of SNP in inbred rats based on multiplex PCR-LDR technology was cons
20、tructed.9 commonly used rat strains from two other domestic rat suppliers were detected by this protocol.Finally,the feasibility of this protocol was verified by comparing the amplification effects of different DNA polymerases by a third-party laboratory.Results When using the constructed SNP detect
21、ion protocol for inbred rats to test 5 rat strains,all sites in each sample obtained good amplification results.The 9 commonly used rat strains from two other rat suppliers in china were also well amplified by this SNP detection protocol,and 40 SNPs were homozygous in each Inbred strain.The results
22、of detection of the same rat DNA samples with three different DNA polymerases showed that the Multiplex PCR Kit,AmpliTaq Gold 360 DNA polymerase and Platinum II Taq hot start DNA polymerase had electrophoretic peaks of amplification products at all SNP sites in groups 1 to 3,and Platinum II Taq hot
23、start DNA polymerase had one less electrophoretic peak of the amplification products at the SNP sites in group 4.In addition,inter-laboratory comparisons showed consistent results for the same amplification system.Conclusion Based on multiplex PCR-LDR technology,this study successfully established a
24、 SNP detection protocol for rats covering all autosomes and X chromosomes with the excellent stability and repeatability.Key words Inbred rats;Single Nucleotide Polymorphisms;Multiplex PCR-LDR;Genetic detection;Verification生物医药研究离不开遗传质量稳定的实验动物。在构建动物模型、探索疾病发生机制、寻找药物靶点时,研究人员一般倾向于选择遗传背景一致的动物,以减少个体差异对实验
25、结果的干扰,提高实验的重复性和精确性。但动物在传代过程中可能会由于引种不当、基因漂变、保种/繁殖等原因,导致遗传质量下降1。欧美等生物医药发达国家早已将遗传质控列为实验动物资源保存的重要工作之一,投入大量经费开展遗传检测及种群质量控制研究,并由此支撑生命科学和生物医药产业的创新研究和发展2。近年来,我国的实验动物遗传质控工作也越来越受到国家重视,2023 年 7 月 1 日开始实施的新国家标准 GB 149232022实验动物 遗传质量控制3在近交系大鼠、小鼠遗传检测方法中,提供了近交系大鼠、小鼠可用短串联重复序列(short tandem repeats,STR)和单核苷酸多态性(singl
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