基于高通量测序的明日叶不同组织内生菌群落结构分析.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 1622基于高通量测序的明日叶不同组织内生菌群落结构分析刘雯雯1,2,张旭3,黄奇2,胡连清2,陈露2,周万海1,2*,魏琴1,冯瑞章1*,赵鑫1(1宜宾学院四川省油樟工程技术研究中心,四川宜宾644007;2宜宾学院农林与食品工程学部,四川宜宾644007;3海南大学生命科学学院,海南海口570228)摘要:【目的】分析明日叶不同组织内生菌的群落结构和多样性,为探究明日叶和内生菌互作机制及功能菌株筛选提供参考。【方法】以四川宜宾栽培的药食兼用型明日叶为试材,采用Illumina MiSeq高通量测序技术确定根、茎、叶和果实组织内生真菌和内生细菌群落多样性。【结果
2、】根据97%的序列相似性水平,将内生真菌和细菌的reads分别归类为1023和1871个操作分类单元(OTU)。韦恩图和热图显示明日叶各组织内生真菌和内生细菌群落结构差异性较高,种群丰度存在一定的差异。多样性分析发现明日叶的叶内生真菌种类数最多,根内生真菌群落多样性最低,果实内生真菌群落丰富度最低;而根含有内生细菌种类数最多,茎内生细菌群落多样性最低,果实内生细菌群落丰富度最低。多样性分析表明,组织特征对明日叶内生真菌或内生细菌群落结构有显著影响。明日叶4个不同组织中的优势真菌门和细菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)和变形菌门(Proteobacteria)。根、茎、叶和果实中内生真菌
3、优势属分别为Serendipita、Paramycosphaerella、多臂菌属(Trichomerium)和Apiotrichum,内生细菌优势属分别为罗尔斯通菌属(Ralstonia)、罗尔斯通菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)和弧菌属(Vibrio)。线性判别分析(LEfSe)表明,除根外,明日叶的茎、叶和果实中内生真菌重要差异指示种分别是Paramycosphaerella、苍白尾孢属(Pallidocercospora)和横断孢属(Strelitziana);茎、叶和果实中内生细菌重要差异指示种分别是罗尔斯通菌属、甲基杆菌属和亮杆菌属(Leucobacter)。经
4、FUNGuild和COG功能预测发现,不同组织内生菌群功能丰富,除具有固氮、促生和抑菌等功能的菌群外,还存在较大比例未知功能菌群。【结论】明日叶中蕴含丰富多样的内生菌群,在不同组织中的群落结构、多样性、优势菌属及差异指示种存在保守性与差异性,组织特征差异是影响内生菌群的重要因素;不同组织内生菌群生态功能亦差异较大,且大量为未鉴定出种属和未定义的功能菌群。关键词:明日叶;内生真菌;内生细菌;多样性;功能预测中图分类号:S567.239文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)06-1622-11收稿日期:2023-04-15基金项目:四川省自然科学基金项目(2022NSFSC0176
5、);四川省科学技术厅应用基础项目(2018JY0495);宜宾市科技局高端创新创业团队项目(2021YGC03)通讯作者:周万海(1979-),https:/orcid.org/0000-0002-8013-0029,博士,副教授,主要从事农业资源开发利用研究工作,E-mail:;冯瑞章(1978-),https:/orcid.org/0000-0002-1601-5843,博士,教授,主要从事微生物资源开发利用研究工作,E-mail:第一作者:刘雯雯(1991-),https:/orcid.org/0000-0002-8659-430X,主要从事微生物学研究工作,E-mail:南方农业学报J
6、ournal of Southern Agriculture2023,54(6):1622-1632ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.004Community structure analysis of the endophyte in differenttissues of Angelica keiskei(Miq.)Koidz.based onhigh-throughput sequencingLIU Wen-wen1,2,ZHANG Xu3,HUANG Qi2,HU Lian-qin
7、g2,CHEN Lu2,ZHOU Wan-hai1,2*,WEI Qin1,FENG Rui-zhang1*,ZHAO Xin1(1Sichuan Cinnamomum longepaniculatum Engineering Technology Research Center,Yibin University,Yibin,Sichuan 644007,China;2Faculty ofAgriculture,Forestry and Food Engineering,Yibin University,Yibin,Sichuan 644007,China;3School of Life Sc
8、ience,Hainan University,Haikou,Hainan 570228,China)Abstract:【Objective】The community structure and diversity of endophyte in different tissues of Angelica keiskei6期16230引言【研究意义】明日叶 Angelica keiskei(Miq.)Koidz.属伞形科当归属草本植物,是一种经济价值极高的药食两用植物(Gong et al.,2020)。药用植物的次生产物积累、药用品质和抗病等与组织内微生物有复杂的作用关系,内生菌能对宿主植
9、物物质循环和能量转换过程中的信号识别、信号转导和基因表达等产生显著影响,从而促进植物对营养成分的吸收和代谢(蔡媛等,2021),部分内生菌还可代谢产生与宿主相同或相似作用的天然活性成分,此特征已成为挖掘新型药物的重要来源(郭文秀等,2022)。因此,开展特色药食两用植物明日叶不同组织的内生菌群落结构及多样性研究,有助于揭示明日叶不同组织内生菌群落结构特征,且对挖掘可提高其有效成分含量的内生菌资源及开发促进明日叶生长、生物转化和品质提升的方法具有重要意义。【前人研究进展】目前已对蛇足石衫、黄精和白蔹等多种药用植物内生菌群落结构、多样性和组织分布特征等开展了相关研究(Fan et al.,2020
10、;李鉴滨等,2022),亦对内生菌响应宿主植物内环境因子及调节宿主植物生长、活性次生代谢物积累和分布进行了分析(黄雪珍和赵龙飞,2023),发现内生菌分布于植物器官或组织中,每个植物器官均代表内生细菌群落特有的生态位。Dong等(2018)对中草药三七不同部位的内生细菌进行多样性分析,得出根部的慢生型大豆根瘤菌、鞘氨醇单胞菌和苯基杆菌等内生细菌数量均高于茎部和叶部。许国琪等(2021)发现青藏高原冰川棘豆不同组织间形成了保守性内生细菌和特异性内生真菌共存的群落结构,为其不同组织适应极端环境提供帮助。陈美琪等(2023)发现对虎耳草不同组织内生真菌的多样性指数均高于多数已报道的其他药用植物,且根
11、部内生真菌的多样性明显高于茎部和叶部。张丽芳等(2023)发现火棘根中内生细菌物种最丰富,参与各种代谢调控的细菌丰度最高。关于明日叶的研究主要集中在栽培技术、活性物质提取与鉴定及中药药性探析等方面。关于内生菌,本课题组前期采用纯培养法筛选明日叶不同器官可培养的内生真菌和产黄酮菌株,浅析了明日叶不同组织内生真菌群落结构和多样性,但分离的菌株数量和类型较少,多样性较低(刘雯雯等,2022)。大量研究表明传统的平板分离法并不能真正反映内生菌群落特征,高通量测序技术能提供更加可靠和深入的分析(陈美琪等,2023)。【本研究切入点】有关明日叶内生细菌的群落结构及组织差异尚缺乏系统的认识。【拟解决的关键问
12、题】收集四川宜宾栽培的药食兼用型明日叶的根、茎、叶和果实组织,基于高通量(Miq.)Koidz.was analyzed,to provide a theoretical basis to explore the interaction mechanism and functional strainscreening of A.keiskei and endophyte.【Method】The medicinal and edible plant A.keiskei,which was cultivated in Yibin,Sichuan,was taken as the object.Th
13、e diversity of endophytic fungi and bacteria in the root,stem,leave and fruit tissueswas examined by high-throughput sequencing using Illumina MiSeq.【Result】According to the 97%sequence similarity,endophytic fungal and endophytic bacterial reads could be indentified into 1023 and 1871 operational ta
14、xonomic units(OTU),respectively.A Venn diagram and a heatmap showed that there were fairly high community structure differencebetween endophytic fungi or endophytic bacteria in the four different parts of tissues of A.keiskei,and the abundances ofpopulations differed.According to diversity analysis,
15、the variety of endophytic fungi in the leaves of A.keiskei was themost,the diversity of endophytic fungal community in the roots was the lowest,and the abundance of endophytic fungalcommunity in the fruits was the lowest.The variety of endophytic bacteria in the roots of A.keiskei was the most,thedi
16、versity of endophytic bacterial community in the stems was the lowest,and the abundance of endophytic bacterial com-munity in the fruits was the lowest.diversity analysis showed that the characteristics of tissues had a significant effect onthe community structure of the endophytic fungi or endophyt
17、ic bacteria in A.keiskei.Ascomycota and Proteobacteria werethe dominant fungal phylum and bacterial phylum in the four different parts of tissues of A.keiskei respectively.The domi-nant genera of endophytic fungi in the roots,stems,leaves and fruits were Serendipita,Paramycosphaerella,Trichomeriuman
18、d Apiotrichum respectively,and the dominant genera of endophytic bacteria were Ralstonia,Methylobacterium andVibrio respectively.Linear discriminant analysis showed that,the most important biomarkers of the endophytic fungi inthe stems,leaves and fruits were Paramycosphaerella,Pallidocercospora and
19、Strelitziana respectively.The most impor-tant biomarkers of endophytic bacteria in stems,leaves and fruits were Ralstonia,Methylobacterium and Leucobacterrespectively.FUNGuild and COG functional predictions showed that the function of endophyte in different tissues wasabundant,and there was a large
20、proportion of unknown functional endophyte in addition to those that could fix nitrogen,promote growth and inhibit bacteria.【Conclusion】There are abundant and diverse endophytes inA.keiskei.The communitystructure,diversity,dominant genera and biomarkers in different tissues are conservative and diff
21、erent,and the differenceof tissue characteristics is an important factor affecting the endophyte.The ecological functions of endophyte in differenttissues are also quite different,and a large number of species and functional endophyte are not identified.Key words:Angelica keiskei(Miq.)Koidz.;endophy
22、tic fungi;endophytic bacteria;diversity;function predictionFoundation items:Sichuan National Natural Science Foundation(2022NSFSC0176);Application Project of SichuanScience and Technology Department(2018JY0495);High-level Innovation and Entrepreneurship Team Project of YibinScience and Technology Bu
23、reau(2021YGC03)刘雯雯等:基于高通量测序的明日叶不同组织内生菌群落结构分析54卷南 方 农 业 学 报 1624测序技术分析明日叶不同组织中内生真菌和内生细菌群落组成和多样性,并比较内生真菌和内生细菌群落结构差异,探究明日叶中特有的微生物资源及其功能,为探寻功能微生物资源和明日叶的功能开发应用,挖掘能合成或促进植物活性产物的菌株资源提供理论依据和技术支撑。1材料与方法1.1试验区概况明日叶采样点位于四川省宜宾市宜宾学院试验农场(东经10459 76,北纬2847 77)。属中亚热带季风湿润气候,气候温和,热量丰足,雨量充沛,光照适宜,冬暖春早,无霜期为347 d,年平均温度17.
24、5,年均降水量1070.4 mm。1.2样品采集和处理在采集地选择不同位点的5株3年生且长势良好的明日叶植株,将整棵植株挖出,尽量保持根系完整,立即放入内置冰袋的冰盒内运送至实验室,用大量无菌水对明日叶植株表面和根系附着泥土进行冲洗后,用无菌剪刀将不同位品按根、茎、叶和果实组织分开。将不同位点每株明日叶不同组织的混合样品作为一个生物学重复,共设3个重复。称取50 g的各组织样品于超净工作台中无菌水冲洗多次,再依次用75%乙醇(40 s)、3%NaClO(3 min)、75%乙醇(40 s)无菌化处理,最后无菌水洗涤3次,无菌滤纸吸干表面水分,置于-80 超低温冰箱中保存,用于明日叶内生菌群落结
25、构分析。1.3明日叶微生物DNA提取与测序明日叶不同组织样本的总基因组DNA使用FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒进行提取,借助1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计分别测定DNA提取质量和DNA浓度、纯度。PCR使用引物ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)和ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)对内生真菌ITS1区进行扩增;使用引物799F(5-AACMGGATTAGATACCCKG-3)和1193R(5-ACGTCATCCCCACCTTCC-3)对内生细菌16S rDNA的V5V7区进行扩增。
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