transwell实验原理与步骤.doc

(完整版)transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备
1。  无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50 mg/LMatrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干.如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃,30min.另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel （3。9 ug/ul） 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2.  有基质胶的Transwell小室制备
 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液.
二、制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞,其侵袭能力是不同的.个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话,可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
三、接种细胞
① 取细胞悬液100－200 µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 µl.
② 24孔板下室一般加入500 µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板.
③ 培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了.所以，用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了.
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变.同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达,到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象
在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。 
四、结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法：
1.  直接计数法
（1）“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁"是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。
通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台。蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等.个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1)。 不需要固定细胞，直接染色即可。（2）。 配制简单方便。(3). 染色后可以用33％醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570 nm 测其OD值,间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野,也有人用10个，都是随机选取,个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野,不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。
（2）“非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数,个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。 
2.  间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。
（1)MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500 µl含0.5 mg/ml MTT的完全培养基,将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 ℃ 4 h后取出。
③ 24孔板中加入500 µl DMSO，将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10 min,使甲.充分溶解.取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
（2)荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。
(3)结晶紫检测
上文已说过,这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary， — 20 ℃保存；
Tanswell plate：Costar ,USA ， ＃ 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；
苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1。 2 　趋化因子的制备　取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基，37℃，5 %CO2 培养24 h~48h，收集细胞培养上清；4 ℃，12 000rpm 离心,10 min ,取上清；0。22 μm 滤膜过滤除菌；分装，在— 20 ℃保存。
1。 3
transwell 培养板准备　所有操作均需无菌操作.-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃~8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl 无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室，覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃，30 min ，使Matrigel 聚合成胶.已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周.
1. 4
Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay）刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %.Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个） 并加入无血清培养基200 ul .Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子，37℃，5 ％CO2 培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞.小心取出上室，用线拴住，并做好标记，用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水（80 % ，95 ％ ，100 ％） ,二甲苯透明.小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数，取平均数.重复实验两次.
2。 1
NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清　趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多，时间较长且实验步骤繁琐。众所周知，胎牛血清中有趋化因子，我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上,用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ，实验时间节省了很多.因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。
2. 2 　细胞的准备　所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 ％.如果细胞活力小，就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。
2. 3 　擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞　先用干棉签将上室内液体吸去，再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞，在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说，穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。
2。 4 　苏木素染色　上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ，用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去，直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚.在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中，反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。四唑盐试验（MTT)比色试验

四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
MTT溶液：称取250mgMTT,放入小烧杯中,加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，5mg/ml。用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
操作步骤
1。 接种细胞:用0。08％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul.
2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。(培养时间取决于实验目的和要求）
3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮生长的细胞，需离心1000rpm,5min）。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4。 比色：选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果.以时间为横轴,光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
（五）、注意事项
1． 选择适当的细胞接种浓度.在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。
2． 避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。
3． 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔.最后比色时，以空白孔调零
【原理】活细胞的线粒体中存在NADPH相关的脱氢酶类，可将黄色的MTT还原为水不溶性的蓝紫色甲臜,死亡的细胞该酶活性丧失，MTT不被还原，用DMSO溶解甲臜后用酶标仪于490nm波长处检测光密度值。
【方法】按不同肿瘤细胞的生长速率，将一定数量的处于对数生长期的细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔（当然要根据你的实验设计不同的药物浓度），每个浓度均为3个复孔，另设无细胞调零孔。置于37℃，5％CO2培养箱培养一定时间后（时间就要看你的实验设计多长时间，几个时间点了）加入MTT液20μl/孔（MTT用PBS配制成5mg/ml),继续培养4小时,吸出上清液，加入150μlDMSO使甲臜溶解，摇匀,然后用酶标仪测OD570值。
【注意事项】悬浮细胞必须离心后才能吸出上清再加入DMSO.