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土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究.doc
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1、土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究 作者: 日期:2 个人收集整理 勿做商业用途土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究上海交通大学附属中学 高二(9)班 姜北辰 2012092320112目录1、 绪论2、 实验材料及方法3、 结果与数据分析4、 分析总结与讨论5、 参考文献摘要:通过对土壤样本进行初筛和复筛,以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物,对5株微生物的反硝化能力进行测定,其二周时间硝酸盐降解率最高为100%,最低为66.76。对此8株菌株的DNA进行PCR扩增,引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物,发现有三株菌株含有nosZ基因。再对此8株菌
2、株中的7株的16S rDNA进行PCR扩增,鉴定菌种。关键词:反硝化微生物,菌种鉴定,反硝化菌筛选1、 绪论:反硝化作用(denitrification)也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下,还原硝酸盐,释放出分子态氮(N2)或一氧化二氮(N2O)的过程。大部分反硝化细菌是异养菌,例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等,它们以有机物为氮源和能源,进行无氧呼吸,其生化过程可用下式表示:C6H12O6+12NO3-6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3-6H2O+10CO2+4N2+8OH+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气,从而降低了土壤中氮素营养的含量,对农业生产不利。农业上常
3、进行中耕松土,使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用.反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节,可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3减少,消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有利的一面,为人类所利用。反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图,若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在.由于N2O和NO都是温室气体,是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义,即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气1。本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌,测定反硝化能力,鉴定其是否含有nirS和nosZ基因,对此
4、进行综合分析,找出反硝化能力较强的菌株,最终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后,此菌株将有十分广大的应用前景。例如,将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原,减少温室气体的排放,为维持环境的稳定起到积极作用.2、 实验材料与方法(1) LB液体培养基 (每1000ml) 10g蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分.(2) TSA培养基:胰蛋白胨0。75g/L大豆胨 0。25g/LNaCl 0。25g/L(3) Giltay培养基A溶液:KNO3 1。0g。天冬酰胺1.0g,1%BTB酒精溶液5mL,蒸馏水500mLB溶液:柠檬
5、酸钠8.5g, MgSO47H2O 1。0g,FeCl36H2O 0。05g,KH2PO41。0g,CaCl22H2O 0。2g,蒸馏水500mL混合A、B溶液,加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7。1,灭菌备用。(4) 琼脂糖凝胶电泳 全基因组电泳:TAE buffer 30ml琼脂糖0.8(0。24g) PCR产物电泳:TAE buffer 50ml 琼脂糖1.2%(0。6g) 均加入荧光剂EB 1微升(5) BeadBeater法所用试剂 bufferZ :10mM TrisHCl, 150mM NaCl, pH 8.0 (1。21g Tris碱,8。755g NaCl, 加HC
6、l调至pH 8.0, 配成1L溶液) 10SDS(C12H25OSO3Na)100g溶于1L水 pH 5.3 氯仿-异戊醇(24:1) 苯酚(pH 8.0) 无水乙醇 Eirconium beads Screw tube(6) PCR反应体系(25l) 10buffer 2。5l Taq酶 0.25l MgCl2 2l dNTP 2l primer1 0。5l primer2 0。5l 水 16。25l 模板 1l nosZ nirSprimer1 nosZ F R3cdprimer2 nosZ R cd3aF(7) 修正PCR反应体系(50L) 10buffer 5L Taq酶 1L dNT
7、P 7L primer1 1L primer2 1L 模板 12L DMSO 1L ddH2O 33L(8) PCR反应引物序列及条件目的基因引物引物序列(53)反应条件nirS2cd3aFGTS AAC GTS AAG GAR ACS GG94 for 2min,30(94 for 30s,51 for 1min,72 for 1min),72for 10minR3cdGAS TTC GGR TGS GTC TTG ANosZ3nosZ FCGY TGT TCM TCG ACA GCC AG94 for 2min,3(94 for 30s,65 for 1min,72 for 40s),4(
8、94 for 30s,60 for 1min,72 for 1min),18(94 for 30s,55 for 1min,72 for 1min),72 10minnosZ RCAT GTG CAG NGC RTG GCA GAA(9) 化学转化体系:pMD18-T载体 0.5LDNA 4.5LSolution I 5L载体与Solution I为TaKaRa公司产品(10) 仪器、试剂:普通离心机、冷冻离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、PCR仪、凝胶电泳槽、水浴锅、冰浴、金属浴仪、紫外照胶仪、快检器,实验所用化学药品均为分析纯。(11) 初筛:先将
9、土壤样本稀释100倍作为样本.提取样本,稀释为10-3、104、10-5、106、10-7、10-8六个梯度,各500微升.其中, 105、106、107三个浓度各涂两个平板,其余各涂一个平板。再加上10-2浓度在平板上进行划线,总计10个平板。平板上培养基为TSA培养基。然后将平板放入厌氧培养箱中18培养一个星期。(12) 菌落集中培养:另取一平板,在其背面贴上50格的方格纸,然后从106和 107的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上(记为A)和右下方(记为B)。(其上菌落的编号方法:方格号+位置,例:10A、44B).共计100个菌落。将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周
10、。此平板记作“平板A(13) 复筛:使用移液枪头挑取平板A上较明显且较有代表性的10个菌落接种进预先加好Giltay培养基与BTB的大试管内,记下编号,培养一周.接种到大试管中的细菌编号:17A、17B、19A、19B、23A、23B、38B、41A、42A、43A。BTB变蓝的试管编号:17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A、43A.将所有平板密封放入冰箱保存,将大试管放入振荡培养箱继续培养.一周后,提取大试管中的培养液,开始测量硝酸盐的降解程度。此时,菌已在大试管中培养三周(28)。使用仪器为紫外分光光度仪,波长为220nm与275nm。记录实验数据,将结果进行数学模型拟合
11、,推算出硝酸盐降解程度。(14) DNA提取与PCR扩增: 配制LB液体培养基100ml,取16个试管,将有反硝化能力的8株菌株接种到试管中,进行好氧培养,16小时后放4保存。 使用煮菌法从平板A上提取DNA,把已知的反硝化基因nirS和nosZ基因为目的基因,使用相应引物,进行PCR扩增,电泳后比对。通过研究比对看具有反硝化能力的菌是否含有这两种基因. 取4保存的菌液使用Beadbeater法提取高纯度DNA。 用此DNA作为扩增16S rDNA的模板,引物为16S rDNA全程引物(27F、1492)。同时使用此DNA对目的基因PCR作复核,重复三次实验.(15) 琼脂糖凝胶电泳(8个菌株
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