细菌染色技术ppt.ppt

细 菌 染 色 技 术细菌染色方法细胞不染色而背景染色燃料与细胞结合而染色常用的染色方法革兰染色：最经典常用；革兰阳性、阴性菌；初步识别特殊形态抗酸染色：抗酸性、非抗酸性细菌；用于结核病、麻风病等荧光染色：敏感性强、效率高、易观察；用于结核分枝杆菌等其它：鞭毛染色鞭毛有无、位置、数量；异染颗粒染色白喉棒状杆菌；荚膜染色常用燃料碱性染料碱性染料 带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。常用的染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。酸性染料酸性染料:显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。通常用来染细胞质，而很少用于细菌的染色。常用的染料有伊红、刚果红等。复合染料（中性染料）：复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染料荧光染料：如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。用于某些特殊的染色技术。脂溶性染料脂溶性染料 如Sudan black。染色方法的分类1.单染法:采用一种染料染色 如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。2.复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。染色过程涂片涂片干燥干燥固定固定 染色染色水洗、吸干镜检镜检细菌基本形态结构基本形态u球菌u杆菌u弧菌特殊结构u芽孢：枯草杆菌、破伤风梭菌u荚膜：肺炎链球菌u鞭毛：变形杆菌标本处理痰液：痰液：用无菌棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml，涂于载物玻片右2/3 处，均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm长),每张玻片只涂一份标本。脓液：脓液：同痰涂片法。病灶组织或干酪块等：病灶组织或干酪块等：先用组织研磨器磨碎后再行涂片。大小、厚度同痰涂片。体液标本：体液标本：取标本10ml，3000rpm,离心30min，取沉渣涂片。大小、厚度同痰涂片。脑脊液：脑脊液：将脑脊液离心或甩片集菌后涂片备用。大便：大便：取粘液便或者血便少量均匀涂布玻片，不可过厚。标本处理注意事项标本应以打圈的方式反复涂抹均匀，避免标本涂布不均影响结果判读，或使染色不均造成阴阳不定。标本涂布不能过厚，影响染色效果。体液标本应浓缩集菌后取沉渣涂片。普通染色法革兰染色法（Gram Stain）是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于18821884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。一、原理一、原理 细菌经结晶紫初染染成蓝色。G+菌细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而G-菌细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。结晶紫初染结晶紫初染碘液媒染碘液媒染乙醇脱色乙醇脱色复红复染复红复染涂片固定涂片固定二、步骤标本处理标本处理 用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。三、结果三、结果:阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色 固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G G+”或“GPGP”（Grams Positive）表示。革兰氏阴性菌，用符号“G G”或“GNGN”（Grams Negative）表示。四、影响因素1.1.操作：操作：涂片的厚薄，不宜过厚染色时间的把握，尤其是脱色时间，脱色不宜过度固定过程不可用酒精灯直接加热，避免过热使菌体变性而影响染色效果。2.2.染液染液 染液用完后应及时盖上盖子，以免挥发影响染色效果3.3.细菌因素细菌因素 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如培养时间过长革兰阳性菌可能染成阴性，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。某些细菌存在染色困难、不易脱色等情况，可能会出现染色不均，阴阳不定的现象。五、临床意义鉴别细菌：用革兰氏染色法可将所有细菌分为阳性与阴性两类，可初步识别细菌，以利进一步鉴定。选择药物：可根据革兰氏染色性的不同，供临床初步选择用药方向。与致病性相关：大多数革兰氏阳性菌的致病物质为外毒素，而大多数革兰氏阴性菌的致病物质为内毒素。由此，可采取有针对性的治疗方案。革兰氏阳性葡萄球菌例子革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄金黄色葡萄球菌色葡萄球菌 x 1000)革兰氏阳性链球菌例子革兰氏阳性链球菌例子革兰氏阴性杆菌例子革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌大肠杆菌 x 1000)革兰氏阴性弧菌例子革兰氏阴性弧菌例子革兰氏阳性产芽孢杆菌例子革兰氏阳性产芽孢杆菌例子 革兰氏阳性短杆菌例子革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特李斯特菌菌 x 1000)革兰氏阴性弯曲菌例子革兰氏阴性弯曲菌例子革兰氏阳性棒状杆菌例子革兰氏阳性棒状杆菌例子抗酸染色法 一、原理 结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），也就易于鉴别。涂片固定 酸性复红初染 3%盐酸酒精脱色 美蓝复染 镜检标本处理二、步骤染色过程中的细菌颜色变化：抗酸杆菌非抗酸杆菌三、结果三、结果:抗酸菌抗酸菌红色红色；非抗酸菌非抗酸菌蓝色蓝色。抗酸染色注意事项每张玻片只能涂一个标本，以免染色过程中因冲洗使菌体脱落，造成阴阳性结果混淆；注意生物安全，自我防护；脱色时间依据涂片厚薄适当调整，以无红色为止。抗酸染色的意义：用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风杆菌）和非抗酸菌。荧光染色法一、原理一、原理 抗酸杆菌用荧光燃料Auramine O(金胺O)染色后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，将会发出闪亮的橘黄色。这种方法可用较低倍镜头镜检，因此能快速找出抗酸杆菌。二、步骤：涂片固定 金胺O染色 盐酸酒精脱色 复染 镜检涂布均匀，不可过厚时间可稍微延长，但不可少于规定时间脱色时间依片子厚薄适当调整复染时间不可过长荧光显微镜观察有无黄绿色荧光标本处理三、结果:阳性阳性明亮橘黄色荧光；明亮橘黄色荧光；阴性阴性无荧光无荧光 三、临床应用：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。四、注意事项：荧光染色法可以作为分枝杆菌的初筛实验，初筛阳性的须做抗酸染色确认。特殊结构染色法 细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色，须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察和区别。负染色法 所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细菌本身在近乎中性的环境中也带负电荷，同种电荷相排斥，故染色时菌体不着色，而只能使背景着色。实践中常用墨汁负染色法配合单染色法（如美兰染色法）检查细菌的荚膜，使背景成黑色；菌体呈蓝色；而荚膜不着色，从而使荚膜包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。墨汁染色法标本：脑脊液处理方法：离心或用细胞离心机离心浓缩染色方法：墨汁染色（负染色）结果：在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊结构染色法。特殊染色鞭毛染色质量控制 每批或每天染色时应同步进行质控，质控方法如下：被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。染色方法质控菌株阳性阴性革兰染色Sau ATCC25923Eco ATCC25922紫色红色抗酸染色H37RVEco ATCC25922红色蓝色荧光染色H37RVEco ATCC25922橘黄色荧光无荧光常见细菌图例肺炎链球菌肺炎链球菌无乳链球菌化脓链球菌缺陷乏养菌脑膜炎奈瑟氏菌淋病奈瑟菌产单核李斯特菌红斑丹毒丝菌奴卡氏菌豚鼠/嗜水气单胞类鼻疽单胞菌巴斯德菌属阴道加特纳菌军团菌产气荚膜梭菌巴斯德菌霍乱弧菌新型隐球菌布鲁氏菌谢谢谢谢!！!