微生物的生长-PPT.pptx

微生物的生长一、生长与繁殖得基本概念何谓生长？同化作用大于异化作用时,细胞质得量增加,表现在细胞体积或重量得不断增加,这种现象称生长。何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂,这就就是细菌得繁殖。个体得生长和繁殖体现为群体得生长。(微生物重量或数目得增加)。群体生长个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖在微生物学中“只有群体得重复”才更有意义,因此“生长”一般指群体生长。第一节 微生物的生长及其特性2二、微生物生长得测定方法第一节 微生物的生长及其特性生理指标法计数法生物量法定量测定方法直接计数法（显微镜）间接计数法（关注：活细胞染色法、特定细胞计数法）体积法重量法（湿重法、干重法）组分法元素法呼吸强度耗氧量酶活性生物热31、计数法(1)直接计数法(显微镜)涂片染色法:一定量样品涂布在载玻片上,染色后计数。滤膜染色法:一定量样品过滤到滤膜上,然后染色计数。计数之前都需把样品预处理分散分散第一节 微生物的生长及其特性4Measurement of total cell counts全细胞染色法(死活不分):DAPI染色染色,DTAF染色染色第一节 微生物的生长及其特性DNADAPI:46-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride2Cl-H2N+NH2CNHH2N-C NH2DAPI染色染色5DNA5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinOOHOOHOOHNHNNClNClDTAF染色法染色法第一节 微生物的生长及其特性6计数器法:如血球计数板法比例计数法:将已知颗粒浓度得液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下,测各自得数目。(特点:不需测量体积)第一节 微生物的生长及其特性7美蓝染色法（酵母活细胞计数）活细胞：无色死细胞：蓝色口丫啶橙染色法（在紫外显微镜下观察细胞的荧光）活细胞：橙色荧光死细胞：绿色荧光 活细胞染色法第一节 微生物的生长及其特性8Tetrazolium salt reduction methodFormazanNHRNNRNRCH甲撍化合物Tetrazolium chlorideNRRNNNCl-+R四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物(染料)染色法第一节 微生物的生长及其特性9TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride）CNNNN+Cl-无色；被还原后生成红色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：Triphenyl formazanCNNHNN2H+HCl第一节 微生物的生长及其特性常用得四氮唑化合物(染料)10CTC:5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3H第一节 微生物的生长及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF:CTC-formazane11大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点双重染色法DTAF和CTC双重染色法10m第一节 微生物的生长及其特性13 低活性细胞得计数(细胞增大技术)DVC(Direct Viable Count)methodNNH3CNalidixic acid（萘啶酮酸）(1-ethyl-1,4,dihydro-7-methyl-4-oxo-1,8-aphthyridine-3-carboxylic acid)30C,18 hour incubatedNalidixic acid Yeast extract第一节 微生物的生长及其特性14(2)间接计数法(活菌计数法)平板计数法:测定菌落数,(注意:可培养得微生物很少)描述:CFU(colony formation unit)液体计数法(MPN法,most probable number法):最可能数法 主要用于在平板培养基上不易形成菌落得菌 (硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌)液膜法:过滤到滤膜上(把膜放在固体培养基上培养)第一节 微生物的生长及其特性1516(3)特定微生物计数法平板法液体法e.g.Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亚硝酸菌、硝酸菌的计数FISH(荧光杂交法)Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA得碱基组成设计特异得探针(probe)选择性培养基法第一节 微生物的生长及其特性17Principle of fluorescent in situ hybridization(FISH)rRNAOligonucleotide probeFluorescence第一节 微生物的生长及其特性18FISH法得步骤法得步骤萤光标示探针(Probe)渗透rRNA細胞Hybridization萤光显微镜观察、计数第一节 微生物的生长及其特性1910mFISH法法DTAF染色染色土壤中微生物得测定(例子)微生物微生物同视野第一节 微生物的生长及其特性202、生物量法(1)测体积:离心或自然沉降后观察体积(粗放得方法)(2)测细胞干重:离心法、过滤法两种 105110C下干燥后称重(干重约为湿重得1020%)活性污泥浓度测定方法:MLSS（mixed liquid suspended solid）混合悬浮固体MLVSS（mixed liquid volatile suspended solid）550C、2h、马福炉(3)比浊法/光密度法 OD(optical density)450660nm,可见光第一节 微生物的生长及其特性21(5)细胞含氮量 细菌含氮量12、5%、酵母为7、5%粗蛋白量6、25N量(6)DNA、蛋白质 同一微生物得DNA和蛋白质含量相对稳定,所以可以通过测量DNA、蛋白质得量评价生物量。(7)ATP、RNA可以反映活性微生物得量(8)微生物呼吸醌类 1g含活性污泥平均约含1mol呼吸醌类。（4）测细胞含碳量POC（particulate organic carbon）POC12X mg/l特点：快、低浓度也可测TOC（total organic carbon）：总有机碳DOC（dissolved organic carbon）：溶解性有机碳第一节 微生物的生长及其特性22三、微生物得生长特性1、间歇培养(Batch cultivation)和生长曲线(growth curve)接种第一节 微生物的生长及其特性间歇培养:将少量微生物接种于一定量得液体培养基内,在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。生长曲线:细胞量随时间得变化曲线称生长曲线。23总细胞数微生物得典型生长曲线活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性2400时间微生物数生长速度缓慢期对数期稳定期衰亡期活菌数总菌数微生物生长曲线(按微生物数目得对数绘制)25时间活微生物重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段微生物生长曲线（按微生物重量绘制）微生物生长曲线（按微生物重量绘制）第一节 微生物的生长及其特性261)缓慢期(亦称延滞期,lag phase)影响缓慢期长短得因素:接种龄:种子(inoculum)处于什么生长期。、接种量:特别就是X0/S0,即初期微生物浓度与基质浓度得比。培养基成分产生缓慢期得原因:缺乏分解有关基质得酶;缺乏充足得代谢中间产物 总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数特点:生长速率常数近于零 细胞形态变大 rRNA含量增高 合成代谢较活跃第一节 微生物的生长及其特性272)对数期(stationary phase)亦称指数期(exponential phase)最短总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数细胞数(量)以指数形式增加得时间段。特点:生长速率最大,世代时间(generation time)倍加时间(doubling time)酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长,体内各成分最为均匀 第一节 微生物的生长及其特性28指数期得数学描述世代时间n 世代数第一节 微生物的生长及其特性293)稳定期(stationary phase):亦称恒定期、最高生长期、生长速率下降期等特点:净增长速度接近零繁殖与死亡速度几乎相等正生长与负生长几乎相等生长速率下降阶段 S很低,其浓度对微生物影响大即有机物分解速率与其浓度成正比出现稳定期得原因:营养物尤其就是生长因子耗尽 营养物比例失调代谢物得积累 pH、DO、氧化还原电位得变化第一节 微生物的生长及其特性304）衰亡期（decline phase,death phase）内源呼吸期（endogenous respiration phase）内源呼吸：体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化。特点：细胞形态多型化 细胞会发生自溶现象（autolysis），蛋白质水解酶活力 往往产生芽孢出现衰亡期得原因:营养物不足(代谢产物得积累)外界条件恶化总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性312、间歇培养时微生物生长得数学描述(1)生长与基质浓度得关系微生物比增长速度:单位时间,单位微生物量得增加量基质浓度s第一节 微生物的生长及其特性32Ks:饱和常数，与的s值相等KsS时sKsMonod公式(莫诺特公式)经验公式(微生物增长)第一节 微生物的生长及其特性331)对数期:b x 项忽略不计(2)细胞浓度变化:a:合成系数/菌体收率 污染物转化系数b:内源呼吸常数总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性因为S浓度很高S ks342)稳定期(生长下降期):X 变化不大;xconst3）衰亡期（内源呼吸期）：项可忽略总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性35微生物生长期与废水生物处理:(活性污泥等得混合微生物群,也有类似得生长曲线。)水处理中如何避免缓慢期接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化（以后详细讲）微生物维持在对数期可获得高得处理能力,即分解速率,但处理效果 不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质第一节 微生物的生长及其特性36处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降,但有一定得代谢活性,絮凝沉降性能好。故传统得活性污泥法常运行在这个范围。衰亡期只出现在某些特殊得水处理场合,如延时曝气及污泥消化。第一节 微生物的生长及其特性37食料/微生物比代谢速率内源呼吸阶段生长率下降阶段生长率上升阶段(沉降性能好)(沉降性能差)大多数活性污泥处理系统运行范围延时曝气,污泥消化注意：各个阶段的食物/菌量比(F/M)发生变化，相当于活性污泥系统的污泥负荷。第一节 微生物的生长及其特性微生物代谢速率与食料/微生物比得关系383、连续培养（continuous cultivation）是一种连续进料又连续出料的培养方式根据控制因素的不同分为恒浊连续培养（turbidostat）恒化连续培养（chemostat）进料速度保持一定4.半连续培养（semi-batch cultivation）、半间歇式Fill and draw第一节 微生物的生长及其特性395、分批补料式培养(fed batch)以低速把高浓度得营养物质连续加入培养器中,但不排出物料。体积是随时间变化的特点:能任意控制培养液中得底物浓度,所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡,所以能保持一定得浓度。主要用于:有抑制作用得底物 生长因子添加 高浓度菌体培养添加方法定速添加指数添加dvdt=constant第一节 微生物的生长及其特性40四、微生物膜得生长特性1、生物膜得生长液体培养基中加入固体物质(载体),微生物在其表面吸附、生长、繁殖形成形成膜,这种膜叫微生物膜。第一节 微生物的生长及其特性41从单位固体表面积上得微生物量(mg/cm2)上看可分为6个阶段a、延滞期b、加速增长期c、恒速增长期d、减速增长期e、安定期f、脱落期第一节 微生物的生长及其特性微生物膜得生长模式图42微生物膜得生长过程中密度得变化随着膜厚得增加,密度也发生变化第一节 微生物的生长及其特性43第一节 微生物的生长及其特性微生物膜内部得密度变化44(1)延滞期:细胞吸附在固体表面上得过程(沉降)影响吸附速度得因子:材质、表面性质、形状、细胞得性质、操作条件(2)加速增长期:还没有形成完整得膜(3)恒速增长期:活性细胞量达到最大,形成完整得膜。膜表面凹凸不平。第一节 微生物的生长及其特性45(4)减速增长期:恒速增长期与安定期得过渡期,持续时间短。(5)安定期:增长速度与脱落速度相平衡,膜量及膜厚达到最大值。(6)脱落期:外因:流体得剪切力 内因:微生物得死亡、气泡得形成,细胞外高分子量得变化。第一节 微生物的生长及其特性462、生物膜得特性(1)有效膜厚生物膜并不是全部有活性基质的扩散细胞的死亡70200m(平均100 m),并不就是越厚越好。第一节 微生物的生长及其特性47