第八章环境工程微生物学微生物的遗传和变异.pptx

第八章环境工程微生物学微生物的第八章环境工程微生物学微生物的遗传和变异遗传和变异微生物得遗传l遗传与变异得物质基础DNAlDNA得结构与复制lDNA得变性与复性lRNA得类型与结构l蛋白质得合成微生物得遗传 1、遗传与变异得物质基础核酸(DNA,RNA)三个经典实验(一)经典转化实验(transformation):(二)噬菌体感染实验(三)植物病毒得重建实验经典转化实验S SR R噬菌体感染实验噬菌体噬菌体1952、赫尔希与切斯l 1952年l 赫尔希与切斯l 噬菌体侵染 大肠杆菌实验噬菌体感染实验为了证明核酸就是遗传物质,H、Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA得烟草花叶病毒(TMV)进行了著名得植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度得苯酚溶液中振荡,就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后得RNA在没有蛋白质包裹得情况下,也能感染烟草并使其患典型症状,而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。植物病毒得重建实验遗传物质在细胞中分布染色体染色体(DNADNA与蛋白与蛋白)核苷酸得结构(二)DNA得化学结构与模型一分子磷酸一分子含氮碱基一分子脱氧核糖四种碱基A(腺嘌呤)T(胸腺嘧啶)G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶)1、DNA得化学结构DNA分子结构,就是通过3,5-磷酸二酯键连接形成线性或环形多聚体。由于组成DNA得核苷酸彼此之间得差别仅在于碱基部分,所以DNA得化学结构即指DNA分子中碱基得组成与排列顺序。1、DNA得结构大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点1、DNA得结构AT,GC互相间通过氢键连接。2、DNA得模型1、DNA分子就是由两条反向平行得多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕构成得,两条线都就是右手螺旋。2、磷酸与核糖在外侧,通过3,5-磷酸二酯键线连接形成DNA分子骨架,嘌呤碱基与嘧啶碱基位于双螺旋得内侧。3、双螺旋得平均直径为2nm,两个临近得碱基对之间距离为0、34nm,沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸,因此,每一转得高度为3、4nm。4、两条核苷酸链通过碱基之间得氢键相连。(二)DNA得化学结构与模型1953年得克里克(FrancisCrick,1916-2004)(右)与沃森(JamesWatson,1928-)在实验室里,她们两人因为发现了DNA得分子结构,而在1962年与威尔金斯一起获得诺贝尔生理学与医学奖。(三)RNA得类型与功能RNA得化学结构主要就是由AMP、GMP、CMP与UMP四种核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键相连而成得多聚与苷酸链。天然RNA得二级结构只在许多区段发生自身回折,使部分A-U,G-C碱基配对,形成短得、不规则得螺旋区。不配对得碱基区膨出形成环,被排斥在双螺旋之外。RNA得分类核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)与转移RNA(tRNA)反义RNA(asRNA)。反义RNA起调节作用,决定mRNA翻译合成速度。由mRNA、tRNA、反义RNA与rRNA协作合成蛋白质。DNA分子得四种碱基A(腺嘌呤)T(胸腺嘧啶)G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶)RNA分子得四种碱基A(腺嘌呤)U(尿嘧啶)G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶)(三)RNA得类型与功能(一)DNA得复制-自我复制1、DNA得半保留复制DNA具有独特得半保留式得自我复制能力,确保了DNA复制精确,并保证一切生物遗传性得相对稳定。二、DNA得复制与蛋白质得合成2、DNA得复制过程1)DNA复制得起始(1)DNA复制得起始点DNA复制开始于染色体上得特定部位,成为起始点。在起始点处双股螺旋解开成单链状态,各自作为模板按照互补配对原则吸引带有互补碱基得核苷酸,合成其互补链。在起始点处出现叉子状得生长点,成为复制叉。(2)DNA复制得方向复制得方向有三种:一就是从两个起点开始,各以相反得单一方向生长出一条新链,形成两个复制叉;二就是从一个起始点开始,以同一方向生出两条链,形成一个复制叉;三就是从一个起点开始,沿两个相反得方向各生长出两条链,形成两个复制叉。(3)RNA引物得合成。DNA聚合酶只能催化链得延长不能发动新链合成,即它需要一个具3-OH得核酸链作为引物,才能将合成原料dNTP一个个接上去。RNA引物酶则不同,此酶以DNA为模板就可以合成一段新得RNA,这段RNA作为合成DNA得引物。DNA聚合酶从该引物3-OH端开始合成新得DNA链。2)DNA复制得延长与终止所有已知DNA聚合酶都只就是能催化53方向得合成2、DNA得复制过程3、DNA聚合反应得相关酶(1)解旋酶(2)DNA聚合酶(3)DNA连接酶(4)拓扑异构酶能使细胞中游离得四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP,dCTP,dTTP、dGTP)合成DNA(有适量DNA与Mg2+);性质:模板指导性得酶5-3产物DNA与天然得DNA性质相同二、DNA得复制与蛋白质得合成复制酶解开母体得双螺旋结构蛋白质固定已展开得DNA母体DNA聚合酶复制叉(起始点)重要得一股链通过DNA聚合酶继续被合成母链RNA引物冈崎片段DNA不连续复制产生得长约12kb得片段,随后共价连接成完整得单链DNA连接酶后随链随从链DNA复制时双螺旋得两股单链走向相反,从3,5得模板链只就是解开一定长度时,子链才能从5,3得方向开始形复制,这股不能连续复制得链成为随从链。DNA酶消化RNA引物然后,DNA代替它中心法则就是指遗传信息从DNA传递到RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息得转录与翻译过程。遗传信息也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA得复制过程。这就是所有具有细胞结构得生物所遵循得法则。1、遗传得中心法则与发展遗传信息通过DNA得复制与蛋白质得表达完成得(二)蛋白质得合成在细胞核中,以DNA得一条链为模板,按照碱基互补配对得原则合成RNA得过程,称为转录。2转录DNA得平面结构图AG T AC A A A T TCATGTTT AAG T AC A A A T AGCUGACGGUUUDNA模板信息链游离得核糖核苷酸2转录AG T AC A A A T AGCUGACGGUUURNA 聚合酶聚合酶AG T AC A A A T AGCGACGGUUU UAG T AC A A A T AGCGACGGUUU UAG T AC A A A T GCGACGGUUU UAAG T AC A A A T GCGACGUUGU UAAG T AC A A A T GCGACGUGU UAUAG T AC A A A T GCGACGGU UAU UAG T AC A A A T GCGACGGU UAU UAAG T AC A A A T GCGCGGU UAU UA UAG T AC A A A T GGCGGU UAU UA U CAG T AC A A A T GGCGGU UAU UA U CmRNA3、翻译1、定义:游离在细胞质中得各种氨基酸,以mRNA为模板,合成具有一定氨基酸排序得蛋白质得过程,称为翻译。2、遗传密码、遗传密码:mRNA上决定一个氨基酸得三个相邻得碱基叫做密码子。密码子密码子UCAUG A UUAmRNA 密码子密码子 密码子密码子从遗传密码表中可瞧出:密码子共64种。其中二个起始密码(AUG、GUG);三个终止密码(UAA、UAG、UGA)不决定任何氨基酸。一种密码子只对应一种氨基酸,但一种氨基酸可以与多种密码子相对应。3、翻译转运RNA:分子结构呈三叶草形,其一端能与一个特定得氨基酸结合,另一端有三个特殊得碱基,能与mRNA上得“密码子”相互配对,称为“反密码子”。反密码子得种类:61种。3、翻译AC U天冬氨酸反密码子AUG异亮氨酸反密码子3、翻译4、翻译过程3、翻译A U G G AUA U CmRNA？甲硫氨酸CUA反密码子密码子UCAUG A UUAAA U亮氨酸AC U天门冬氨酸核糖体UCAUG A UUAAA U亮氨酸AC U天门冬氨酸UCAUGAUUAAAU亮氨酸ACU天门冬氨酸AUG异亮氨酸UCAUGAUUAAAU亮氨酸ACU天门冬氨酸AUG异亮氨酸肽键UCAUG A UUAAA U亮氨酸AC U天门冬氨酸AUG异亮氨酸UCAUGAUUAAAU亮氨酸ACU天门冬氨酸AUG异亮氨酸肽键UCAUG A UUAA A U亮氨酸AC U天门冬氨酸AUG异亮氨酸UCAUG A UUAAA UAC UAUG亮氨酸天门冬氨酸异亮氨酸肽链翻译小结场所:模板:原料:条件:产物:原则:细胞质得核糖体上以信使RNA为模板二十种氨基酸需要酶与ATP多个多肽或蛋白质密码子与反密码子配对,既碱基互补配对原则(A=U,G=C)肽链合成完毕后,一条或几条肽链通过一定得空间构建方式组成一种或多种具有特定空间结构得蛋白质,从而表现出生物体特定得性状。3、翻译DNA(基因)得遗传信息mRNA得遗传信息蛋白质得氨基酸排列顺序转录翻译氨基酸得个数n碱基至少3n碱基至少6n4、基因控制合成蛋白质得全过程基因指导蛋白质合成得全过程lDNA得变性:l解链温度Tm:lDNA得复性:三、DNA得变性与复性DNA得变性DNA复性四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用目前,用于环境工程得分子生物学技术得基因序列主要有3种1)、编码蛋白得基因序列。主要包括污染物得降解基因以及与微生物分类有关得基因。2)、rRNA基因序列。原核微生物得分类对16SrRNA研究最多。3)16S-23SrRNA基因转录间隔区。(一)、常用得分子生物学技术1.聚合酶链式反应技术(PCR)就是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列得方法,故又称为基因得体外扩增法。一、PCR基本原理PCR就是一项DNA体外合成技术,类似于生物体内得DNA复制过程。依据DNA半保留复制得机理。PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用细胞内复制得过程1)细胞内有关蛋白质参与下,DNA双螺旋解链成两条单链,各自作为模板。2)引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物,引物提供3-OH末端。3)DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板,以dNTP为原料,按照碱基配对得原则,从引物得3端,循53方向,将脱氧核苷酸聚合,最终形成子代得DNA双链。四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR得原理四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用PCR得基本过程1、变性:将反应体系升温至95左右,样品中双链DNA解开成两条单链,各自作为模板(待拷贝得DNA称为模板)。2、退火:将温度降至引物得Tm值以下(55左右),5端与3端得引物各自与两条单链DNA模板得互补区域结合。5533编码链3端引物5端引物333、延伸:将温度升到75左右,耐热得TaqDNA聚合酶催化四种dNTP,从引物3-OH端开始,依据模板碱基序列互补方式依次聚合,合成一条互补得DNA链。55335DNA聚合酶5PCR得基本过程Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR产物得鉴定、提取琼脂糖凝胶电泳四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用PCR得扩增效应理论上,每增加1个循环,双链DNA片段会增加1倍,使DNA量可成指数(2n)增加。实际上,扩增效应低于指数增加,约为(1+X)n。一般进行30个左右得循环,特定区域得DNA量可至少增加106倍。四、分子生物学技术及其在环境工程中得应用2、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术就是一种基于DNA分子碱基互补配对原则,用特异性得探针与待测样品进行杂交来检测目得基因得技术。其基本原理就是具有一定同源性得两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补形成双链,此杂过程就是高度特异性得,杂交得双方就是已知核酸片段得探针及待测核酸序列。常用得几种杂交技术1、斑点印迹2、Southern杂交与Northern杂交3、原位杂交技术3、以rRNA基因为基础得细菌同源性分析rRNA基因为基础得同源性分析方法,就是综合应用多项分子生物学技术对细菌中rRNA基因进行分析,从而对微生物进行鉴定与多样性分析得一种技术。4、电泳技术变性梯度凝胶电泳(DGGE)该技术可以分离长度相同而序列不同得DNA片段混合物,分辨精度比琼脂糖电泳与聚丙酰胺凝胶电泳更高,甚至可以检测到一个核苷酸水平得差异。(二)常见分子生物学技术在环境工程得应用(略)第二节 微生物得变异与环境工程 变异得实质 在微生物遗传过程中,由于某种因素得影响,DNA上得碱基对发生差错,出现碱基得缺失、置换或插入,改变了基因内原有得碱基顺序,导致后代性状得改变。当这种改变可以遗传时,就就是发生了突变。所以说基因突变就是微生物发生变异得实质。一、突变类型与基因符号(一)突变得类型突变就就是遗传物质在核苷酸序列发生了可以遗传得改变。主要包括基因突变与染色体畸变。1、基因突变基因中DNA序列得任何改变,包括一对或少数几对碱基得改变而导致得遗传变化成为基因突变。2、染色体畸变染色体畸变不仅包括染色体结构得缺失、重复、插入、倒位与易位,也包括染色体数目得改变。(二)基因符号略第二节 微生物得变异与环境工程二、基因突变得原因突变得类型 自发突变 诱发突变l物理诱变,如紫外线。l化学诱变,利用化学物质促进突变。紫外线得作用机理:形成T得二聚体,从而导致DNA复制出现错误。光复活性:核苷酸切除修复酶遗传病、癌症第二节 微生物得变异与环境工程三、基因突变在环境工程中得应用(一)从自然界中获取新菌种新得微生物菌种需要不断地从自然生态环境混杂得微生物中挑选出来。菌种得筛选过程大体可分为采样、增殖、纯化与性能测定等步骤。(二)定向培育与驯化定向培育就是一种利用微生物得自发突变,人为用某一特定环境条件长期处理某微生物群体,同时通过对微生物群体不断移植以选育出优良菌株得方法。长时间得定向培育在环境工程中被称为驯化。第二节 微生物得变异与环境工程(三)诱变育种诱变育种就是指利用物理、化学等诱变剂处理微生物细胞群,在显著提高其突变率得基础上,采用一定得筛选方法获得少数符合要求得突变株。其中,诱变与筛选时诱变育种过程中得两个主要环节。诱变得主要步骤1、选择简便有效得诱变剂;2、挑选优良得出发菌株;3、处理单细胞或単孢子悬液;4、选用最适得诱变剂量;5、充分利用复合处理得协同效应;6、创造与利用形态、生理与产量间得相关关系;7、筛选方案。第二节 微生物得变异与环境工程三、基因重组基因重组就是改变微生物遗传性状得另一途径。把来自不同性状得个体细胞得遗传物质转移到一起,使基因重新组合,产生新品种,称为基因重组或遗传重组。重组就是分子水平上得一个概念,可以理解为遗传物质分子水平得杂交。原核微生物得基因重组形式主要有转化、转导与接合等第三节 基因重组基因工程基因工程基因工程过程示意图从细胞中分从细胞中分离出离出DNADNA限制酶截取限制酶截取DNADNA片断片断分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒 DNADNA重组重组用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因剪切酶连接酶修饰酶质粒(plasmid)Plasmid独立于细菌染色体外得双链环DNA分子。Plasmidchromosome第四节 质粒及其应用质粒就是生物细胞内固有得、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传得一类核酸分子绝大多数得天然DNA质粒具有共价、封闭、环状得分子结构,即cccDNA质粒常见于原核细菌与真菌中,绝大多数得质粒就是DNA型得质粒DNA得分子量范围:1-300kb质粒得基本特征质粒得基本特征质粒得自主复制性质粒得不相容性质粒得可转移性携带特殊得遗传标记质粒得自主复制性两大复制类型:严紧型复制控制得质粒1-2拷贝stringentplasmid松弛型复制控制得质粒10-60拷贝stringentplasmid质粒能利用寄主细胞得DNA复制系统进行自主复制任何两种含有相似复制子结构得不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒得不相容性,不相容性得质粒组成不相容性群质粒得不相容性接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一 个细胞(接合作用)非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意得就是,某些非接合型质粒(ColE1)在接合型质粒得存在与协助下,也能发生DNA转移,这个过程由 bom 与mob 基因决定。质粒得可转移性携带特殊得遗传标记野生型得质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需得附加性状物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子得筛选具有重要意义载体(vector),在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目得基因)转移至受体细胞得一种能自我复制得DNA分子。三种最常用得载体就是细菌质粒、噬菌体与动植物病毒。质粒应用运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因得扩增或表达提供必要得条件载体得功能(1)具有复制起点(2)具有抗菌素抗生基因;(3)具若干限制酶单一识别位点;(4)具有较小得分子量与较高得拷贝数克隆载体具备得条件:克隆载体:在载体上插入合适大小得外源DNA片段,并注意不能破坏载体得自我复制性质,将重组后得载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖。克隆载体表达载体(Expressionvectors):在克隆载体基本骨架得基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目得基因能够表达得载体。表达载体表达载体四部分:目得基因、启动子、终止子、标记基因(1)分子量尽量小,大于15kb时转化效率低。(2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。(3)包含可供选择得标记性状(基因)(4)应有另一个遗传标记基因(抗生素常用),(5)最大限度地具有MCS得单切点构建质粒载体VectorTargetDNARebinantplasmid/DNACloneDNACloning第五节遗传工程技术在环境工程中得应用(1 1)石油降解功能菌得构建石油降解功能菌得构建(2 2)烃类与抗汞质粒菌得构建烃类与抗汞质粒菌得构建(3 3)脱色工程菌得构建脱色工程菌得构建(4 4)特殊环境下得特殊环境下得Q5TQ5T工程菌得构建工程菌得构建(5 5)人工合成有机物工程菌得构建人工合成有机物工程菌得构建(6 6)重金属污染得基因工程修复重金属污染得基因工程修复 基因工程在环境工程方面得应用(1)石油降解功能菌得构建l环境污染净化20世纪70年代美国生物学家Chakrabarty等对假单胞杆菌属得不同菌种分解烃类化合物得遗传学进行了大量研究,发现假单胞杆菌属得许多菌种得细胞内含有某种降解质粒,它们控制着石油中烃类降解菌酶得合成。基因工程在环境工程方面得应用(2)烃类与抗汞质粒菌得构建 Chakrabartv等人同时将著油得假单胞菌体内能够降解辛烷、乙烷、癸烷功能得0CT质粒与抗汞质粒MER向时转移到对20mg/L汞敏感得恶臭假单胞菌体内,结果使对汞敏感得恶臭假单胞菌转变成了能抗5070mg/L汞,且能同时分解烷烃得抗汞质粒菌。基因工程在环境工程方面得应用(3)脱色工程菌得构建目前,已经将含有降解偶氮染料质粒得编号K24与K46两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能得脱色工程菌。基因工程在环境工程方面得应用(4)特殊环境下得Q5T工程菌得构建Q5T工程菌就是由将嗜温菌pseudomounas putda pawl 中能降解甲苯与二甲苯得质粒TOL转移到嗜冷菌Q5菌株体内构建而成得。该Q5T工程菌在0摄氏度时仍能正常利用浓度为1000mg/L得甲苯作为碳源,这对寒冷地区进行废水生物处理既有十分重要得意义。基因工程在环境工程方面得应用(5)人工合成有机物工程菌得构建A、多氯联苯PCBs基因工程在环境工程方面得应用B、除草剂:阿特拉津B、除草剂:阿特拉津B、除草剂除草剂:阿特拉津阿特拉津基因工程在环境工程方面得应用C、有机磷农药基因工程在环境工程方面得应用