蛋白质与酶工程第六章酶的固定修饰与改造.pptx
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1、蛋白质与酶工程第六章酶的固定修蛋白质与酶工程第六章酶的固定修饰与改造饰与改造第一节第一节 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞一、酶得固定化一、酶得固定化二、细胞得固定化二、细胞得固定化三、辅酶得固定化三、辅酶得固定化一、酶得固定化一、酶得固定化(一一)概念及其优缺点概念及其优缺点 固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(immobilized enzyme):(immobilized enzyme):就是指将就是指将水溶性酶经过化学或物理手段处理水溶性酶经过化学或物理手段处理,固定在载体上固定在载体上,在一定得空间范围内起催化作用在一定得空间范围内起催化作用,并能反复与连续并能反复与连续使用得
2、使用得(不溶于水不溶于水)酶。酶。水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶水不溶性酶水不溶性酶(固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶)固定化技术固定化技术固定化技术固定化技术酶固定化得基本要求酶固定化得基本要求 尽可能得保持酶得活性与专一性尽可能得保持酶得活性与专一性;固定化载体应该与酶结合较为牢固固定化载体应该与酶结合较为牢固,不不与底物、产物发生反应与底物、产物发生反应,达到多次回收与反达到多次回收与反复使用复使用;酶固定化后产生得位阻应该较小酶固定化后产生得位阻应该较小,不妨不妨碍酶与底物接近碍酶与底物接近;成本尽可能低。成本尽可能低。固定化酶得优缺点固定化酶得优缺点优点
3、优点优点优点:(1 1)可多次使用可多次使用可多次使用可多次使用;(2 2)可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产(反应反应反应反应););(3 3)不溶于水不溶于水不溶于水不溶于水,易于与产物分离易于与产物分离易于与产物分离易于与产物分离,纯化简单纯化简单纯化简单纯化简单;(4 4)稳定性好稳定性好稳定性好稳定性好,提高产物质量提高产物质量提高产物质量提高产物质量;(5 5)提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。(6 6)应用范围广。应用范围广。应用范围广。应用范围广。缺点缺点
4、缺点缺点:(1 1)首次投入成本高首次投入成本高首次投入成本高首次投入成本高;(2 2)大分子底物较困难大分子底物较困难大分子底物较困难大分子底物较困难;(3 3)固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。(二二)酶固定化得方法酶固定化得方法固定化方法固定化方法固定化方法固定化方法吸附法吸附法吸附法吸附法共价结合共价结合共价结合共价结合(偶联偶联偶联偶联)法法法法交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法网格型网格型网格型网格型微囊型微囊型微囊型微囊型离子交离子交离子交离子交换吸附换吸附换吸附换吸附物理
5、物理物理物理吸附法吸附法吸附法吸附法 无载体无载体无载体无载体固定法固定法固定法固定法多方法多方法多方法多方法联用联用联用联用各类固定化方法得特点比较各类固定化方法得特点比较比较项目比较项目比较项目比较项目吸附法吸附法吸附法吸附法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法 交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法物理吸附物理吸附共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易制备难易制备难易易易易易难难难难易易易易 较难较难较难较难较难较难较难较难固定化程度固定化程度固定化程度固定化程度弱弱弱弱强强强强中等中等中等中等 强强强强强强强强活力回收率活力回收率活力回收率活力回收率较
6、高较高较高较高低低低低高高高高 中等中等中等中等高高高高载体再生载体再生载体再生载体再生可能可能可能可能不可能不可能不可能不可能可能可能可能可能 不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能费用费用费用费用低低低低高高高高低低低低 中等中等中等中等低低低低底物专一性底物专一性底物专一性底物专一性不变不变不变不变可变可变可变可变不变不变不变不变 可变可变可变可变不变不变不变不变适用性适用性适用性适用性酶源多酶源多酶源多酶源多较广较广较广较广广泛广泛广泛广泛 较广较广较广较广小分子底物、小分子底物、小分子底物、小分子底物、药用酶药用酶药用酶药用酶大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询
7、问和交流可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点1 1、吸附法吸附法 根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分:物理吸附法物理吸附法与离子交换吸附法与离子交换吸附法(1)物理吸附法物理吸附法(physical adsortion):通过通过酶与载体之间得范德华力、氢键、疏水酶与载体之间得范德华力、氢键、疏水作用力等将酶与载体联系起来得方法。作用力等将酶与载体联系起来得方法。吸附法吸附法作用力作用力:范德华力、氢键、疏水作用力范德华力、氢键、疏水作用力选择载体得原则选择载体得原则:有机载体与无机载体。有机载体与无机载体。要有巨大得比表面
8、积要有巨大得比表面积;要有活泼得表面要有活泼得表面;便于装柱进行连续反应。便于装柱进行连续反应。常用载体常用载体:氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶原、火棉胶、淀粉等。原、火棉胶、淀粉等。吸附法得类型吸附法得类型根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分:物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法(2 2)离子交换吸附离子交换吸附离子交换吸附离子交换吸附(结合结合结合结合)法法法法(ion bindingi
9、on binding):):通过离子效应通过离子效应通过离子效应通过离子效应,将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。作用力作用力作用力作用力:离子键离子键离子键离子键 常用载体常用载体常用载体常用载体:DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose (二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基-纤维素纤维素纤维素纤维素););DEAE-dextran gel DEAE-dextran gel(二乙氨乙基
10、二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶););CM-cellulose CM-cellulose(羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素;carboxymethyl carboxymethyl cellulosecellulose)。吸附法得优缺点吸附法得优缺点优点优点优点优点:条件温与条件温与条件温与条件温与,操作简便操作简便操作简便操作简便,酶活力损失少。酶活力损失少。酶活力损失少。酶活力损失少。缺点缺点缺点缺点:结合力弱结合力弱结合力弱结合力弱,易解吸附。易解吸附。易解吸附。易解吸附。2 2、包埋法包埋法定义定义:将酶或含酶菌体用物理得将酶或含
11、酶菌体用物理得方法包埋在各种具有特定网状方法包埋在各种具有特定网状结构结构(多孔多孔)载体载体(高聚物高聚物)中中,使使酶固定化得方法称为包埋法。酶固定化得方法称为包埋法。包埋法得类型包埋法得类型分为分为:凝胶包埋法与微胶囊包埋法凝胶包埋法与微胶囊包埋法(1 1)凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法(网格型包埋法网格型包埋法网格型包埋法网格型包埋法):):将酶将酶将酶将酶包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细微网格中。微网格中。微网格中。微网格中。常用得凝胶可分为天然凝胶与人常用得凝胶可分为天然凝胶与
12、人常用得凝胶可分为天然凝胶与人常用得凝胶可分为天然凝胶与人工凝胶。工凝胶。工凝胶。工凝胶。如海藻酸钠、角叉菜胶、明如海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇与光交联树及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇与光交联树脂等合成凝胶。脂等合成凝胶。凝胶包埋法得种类凝胶包埋法得种类聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法:将酶包埋将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中。在聚丙烯酰胺凝胶中。海藻酸钙包埋法海藻酸钙包埋法:凝胶包埋法常用凝胶包埋法常用得载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。得载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。琼脂糖凝胶包埋法琼脂糖凝胶包埋法:利用
13、熔化得琼利用熔化得琼脂在温度低于脂在温度低于50凝固得特性来包埋酶。凝固得特性来包埋酶。使用得多孔载体及其特点使用得多孔载体及其特点凝胶凝胶凝胶凝胶包埋包埋包埋包埋条件条件条件条件酶活性酶活性酶活性酶活性强度强度强度强度天然天然凝胶凝胶琼脂琼脂;海藻酸钙海藻酸钙;角叉菜胶角叉菜胶;明胶明胶温与温与不变不变差差合成合成凝胶凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合聚合反应反应部分部分失活失活高高(2)微胶囊包埋法微胶囊包埋法(半透膜包埋法半透膜包埋法)微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶
14、包埋在各种高聚物制成得半透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。半透膜半透膜半透膜半透膜:直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米,厚约厚约厚约厚约25nm25nm。半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径,小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出,被称为被称为被称为被称为“人工细胞人工细胞人工细胞人工细胞”。它使酶存
15、在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中,可以防止可以防止可以防止可以防止酶得脱落酶得脱落酶得脱落酶得脱落,防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触,从而增加从而增加从而增加从而增加了酶得稳定性。了酶得稳定性。了酶得稳定性。了酶得稳定性。常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。(3)纤维素包埋法
16、纤维素包埋法 常用于大规模生产。通过多孔常用于大规模生产。通过多孔喷丝头形成中空纤维喷丝头形成中空纤维,将酶包埋在将酶包埋在纤维内。纤维内。包埋法得优缺点包埋法得优缺点 优点优点:在于它就是一种反应条件温与、很少改在于它就是一种反应条件温与、很少改变酶结构但就是又较牢固得固定化方法。变酶结构但就是又较牢固得固定化方法。缺点缺点:只有小分子底物与产物可以通过高聚物只有小分子底物与产物可以通过高聚物网架扩散网架扩散,对那些底物与产物就是大分子得酶对那些底物与产物就是大分子得酶并不适合。并不适合。这就是由于高聚物网架会对大分子物质这就是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改
17、变产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变,使活力降低。使活力降低。3 3、共价结合共价结合(偶联法偶联法)(Covalent binding or covalent coupling)共价结合共价结合共价结合共价结合(偶联偶联偶联偶联)法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。(1 1)原理原理原理原理:酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体(固相支持物固相支持物固相支持物固相支持物)表表表表面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得
18、固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化方法。方法。方法。方法。(借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功能基团进行偶连能基团进行偶连能基团进行偶连能基团进行偶连)。(2 2)载体选择得要求载体选择得要求载体选择得要求载体选择得要求:尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体;载体结构疏松载体结构疏松
19、载体结构疏松载体结构疏松,表面积大表面积大表面积大表面积大,有一定得机械强度有一定得机械强度有一定得机械强度有一定得机械强度;载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团;载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附;载体容易获得载体容易获得载体容易获得载体容易获得,能反复使用。能反复使用。能反复使用。能反复使用。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(3 3)酶蛋白可以形成共价键得基团酶蛋白可以形成共
20、价键得基团酶蛋白可以形成共价键得基团酶蛋白可以形成共价键得基团:游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、巯基、巯基、巯基、巯基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、酚基、酚基、酚基、酚基、羟基、羟基、羟基、羟基、甲硫基、甲硫基、甲硫基、甲硫基、吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。酶蛋白酶蛋白N末端得末端得-氨基氨基氨基氨基或赖氨酸残基得或赖氨酸残基得-氨基氨基氨基氨基。酶蛋白酶蛋白C末端得末端得-羧基羧基羧基羧基、天门冬氨酸残基、天门冬氨酸残基得得-羧基以及谷氨酸残基得羧基以及谷氨酸残基得-羧基羧基羧基羧基。半胱氨酸残基得巯基。半
21、胱氨酸残基得巯基。半胱氨酸残基得巯基。半胱氨酸残基得巯基。丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基。组氨酸残基得组氨酸残基得咪唑基咪唑基咪唑基咪唑基。色氨酸残基得色氨酸残基得吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基。苯丙氨酸与酪氨酸残基得苯丙氨酸与酪氨酸残基得苯环苯环苯环苯环。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(4)常用得载体常用得载体:天然高分子、人工合成得高聚物、无天然高分子、人工合成得高聚物、无机载体。亲水载体优于疏水载体。机载体。亲水载体优于疏水载体。天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶纤维素
22、、琼脂糖、葡聚糖凝胶;亲与性亲与性好好,机械性能差。机械性能差。合成聚合物合成聚合物:聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙;机械性能机械性能好好,但有疏水结构。但有疏水结构。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(5 5)载体活化载体活化载体活化载体活化(偶联偶联偶联偶联)得方法得方法得方法得方法:溴化氰法溴化氰法溴化氰法溴化氰法:即即用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将含有羟基得载体含有羟基得载体,如纤维素、葡如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等,活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物,然然后
23、再与酶分子上得氨基偶联后再与酶分子上得氨基偶联,制成固定化酶。制成固定化酶。叠氮法叠氮法叠氮法叠氮法:即即载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物,再与酶分子上得相再与酶分子上得相应基团偶联成固定化酶。应基团偶联成固定化酶。烷基化反应法烷基化反应法烷基化反应法烷基化反应法:以以卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体可与酶蛋白分子可与酶蛋白分子上得上得氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。定化。重氮法重氮法重氮法重氮
24、法:重氮法就是重氮法就是将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基团通过共价键相连接团通过共价键相连接团通过共价键相连接团通过共价键相连接而固定化得方法而固定化得方法,就是共价键法中使用最就是共价键法中使用最多得一种。多得一种。硅烷化法硅烷化法硅烷化法硅烷化法:可在二氧化硅表面引入氨基可在二氧化硅表面引入氨基,活化得表面可以活化得表面可以利用一些中间分子利用一些中间分子(如二氯硫化碳如二氯硫化碳)进一步与酶分子发生连接进一步与酶分子发生连接反应。反应。4 4、交联法交联法 交联法交联法交联法交联法(cross-lin
25、kingcross-linking)就是利用双功能或多就是利用双功能或多就是利用双功能或多就是利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应,形成网状结构得形成网状结构得形成网状结构得形成网状结构得酶固定化方法。酶固定化方法。酶固定化方法。酶固定化方法。由于酶蛋白得功能团,如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基与咪唑基与咪唑
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- 蛋白质 工程 第六 固定 修饰 改造
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