基于复合诱变选育高抑菌活性植物乳杆菌.pdf
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1、研究论文基于复合诱变选育高抑菌活性植物乳杆菌毛银,卢艳波,杨小雁,马忠玛,刘颖颖1,鲍青青1,邓禹*(1.江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心,江苏无锡2 14 12 2;2.山东渤海实业集团有限公司山东省油脂油料精深加工技术重点实验室,山东滨州2 56 50 0)摘要:为了获得高抑菌性能的乳酸菌,以植物乳杆菌DY6为出发菌株,首先对其进行常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,A R T P)和亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)的复合诱变,获得了抑菌活性较强的诱变菌株AN-55、A N-58 及AN-68,其抑菌活
2、性分别提高了19.83%、2 1.9 1%和18.4 0%。随后,经遗传稳定性实验发现菌株AN-55的抑菌性能更加稳定,8 次传代后其抑菌活性较野生型菌株仍能提高2 0.51%。与此同时,菌株AN-55的基因组重测序结果表明,plnK、c p s 4 G p t s 9 D 等基因序列的改变可能对提高菌株抑菌活性有重要影响,为植物乳杆菌在天然防腐剂和抗生素替代物的应用奠定了理论基础。关键词:植物乳杆菌;诱变;抑菌活性;基因组重测序中图分类号:Q939.117文章编号:16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)0 9-0 0 2 0-0 8DOl:10.12441/spyswjs.202208
3、12004Breeding of Lactobacillus plantarum with High Antibacterial ActivityBased on Compound MutagenesisMAO Yin,LUYanbo,YANG Xiaoyan,MA Zhongmd,LIU Yingying,BAO Qinging,DENG Yu(1.National Engineering Research Center for Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing,JiangnanUniversity,Wuxi 214122,China
4、;2.Shandong Key Laboratory of Oil and Oil Deep Processing Technology,Shandong Bohai Industrial Group Company Ltd.,Binzhou 256500,China)Abstract:In order to obtain lactic acid bacteria with high bacteriostatic property,Lactobacillusplantarum DY6 was selected as the starting strain in this study,which
5、 was mutagenized by acompound mutagenesis approach combining atmospheric room temperature plasma(ARTP)andnitrosoguanidine(NTG).The mutant strains AN-55,AN-58 and AN-68 with strong antibacterialactivity were obtained,whose antibacterial activity increased by 19.83%,21.91%and 18.40%,respectively.Subse
6、quently,it was found that the bacteriostatic performance of strain AN-55 wasmore stable through the genetic stability test,and the antibacterial activity still increased by 20.51%even after 8 passages compared to the wild-type strain.At the same time,genome resequencing ofstrain AN-55 revealed that
7、the changes of plnK,cps4G and pts9D gene sequences may have animportant effect on improving the antibacterial activity of the strain,laying a theoretical foundation收稿日期:2 0 2 2-0 8-12 修回日期:2 0 2 2-10-0 7基金项目:山东省重点研发计划项目(2 0 2 2 CXPT042);国家自然科学基金项目(2 18 7 7 0 53);广西壮族自治区重点研发计划项目(桂科AB22035063)。*通信作者:邓
8、禹(19 8 2 一),男,博士,教授,博士研究生导师,主要从事发酵工程、合成生物学研究。E-mail:20JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023研究论文毛银,等:基于复合诱变选育高抑菌活性植物乳杆菌for the application of Lactobacillus plantarum as natural preservatives and antibiotic substitutes.Keywords:Lactobacillus plantarum,mutation,antibacterial act
9、ivity,genome resequencing在食品制造和储藏过程中,致病菌的污染影响了食品的质量安全,对人类健康造成了严重的危害-2 。尽管传统的添加化学防腐剂来延长食品保质期的方法已取得了相当大的进展,但随着人们对“清洁标签”食品需求的不断增加,寻找安全、绿色、高效的防腐物质来取代化学衍生物质具有重要意义3。现代生物技术的不断发展为解决上述问题提供了理论支撑。研究表明,乳酸菌在培养过程中会产生大量抑菌代谢物,如有机酸、脂肪酸、乙偶姻、过氧化氢、蛋白质类化合物、苯乳酸、细菌素和过氧化氢等 4-5。这些物质在不同的体系中可以单独或协同发挥抑菌作用16-7,且不影响食品感官特性和人体健康 8
10、-。因此,使用无毒、无副作用的高抑菌活性乳酸菌及其代谢产物作为天然防腐剂可用于控制食品腐败及致病菌的生长,为食品添加剂安全问题提供了良好的解决方案 10-I,极具应用前景。通过微生物诱变育种的手段来获得高抑菌活性的乳酸菌,是提升菌株抑菌性能的有效方式2。物理诱变虽然具有安全性高、变异范围广等优势,但也存在诱变设备要求较复杂、诱变专一性较差等缺点。化学诱变虽然具有诱变效果强的优点,但操作时存在安全性差的问题。由于物理、化学诱变存在各自的局限性,同时长期的单一处理容易造成生长周期延长、代谢减缓等菌种退化问题,所以常采用多种诱变剂复合处理的方式进行诱变育种 3。复合诱变可以扩大突变的位点,使诱变方式
11、起到协同作用,更易获得性能优良的菌株 4 。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展,具有高抑菌活性菌株的抑菌机理逐步得到阐明。基因组重测序手段可以挖掘全基因组范围内的基因和结构差异,从而获得与抑菌性能相关的变异基因 5。作者所在团队前期从自然发酵的酸菜中筛选到一株抑菌性能较好的植物乳杆菌DY6,并对其抑菌活性物质进行了初步研究,但其抑菌机理尚不清楚 。因此,作者首先通过常压室温等离子体和亚硝基胍对植物乳杆菌DY6进行复合诱变,筛选获得了高抑菌活性的菌株。随后通过基因组重测序技术系统分析了植物乳杆菌DY6和其诱变菌株的遗传差异,对抑菌性能相关的变异基因进行初步挖掘与分析,为植物乳杆菌在饲料和食
12、品防腐领域的应用提供了有益借鉴。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株植物乳杆菌DY6:作者所在实验室保藏;大肠杆菌(ATCC25922):中国普通微生物菌种保藏中心提供。1.1.2培养基MRS培养基(g/L):胰蛋白陈10.0,牛肉膏8.0,酵母粉4.0,葡萄糖2 0.0,K,HP042.0,柠檬酸三铵2.0,CH.C0ONa5.0,MgS047H20 0.58,MnS044H0 0.25,吐温 8 0 1mL;pH 6.36.5,115灭菌30 min。LB液体培养基(g/L):胰蛋白陈10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0;pH自然,115 灭菌 30 min。所有固体培养基中琼
13、脂粉质量浓度为2 g/dL,半固体培养基中琼脂粉质量浓度为1g/dL。抑菌活性测定所用培养基为双层LB培养基,即上层为半固体培养基加指示菌,下层为固体培养基。1.1.3仪器与试剂UV-1800分光光度计:上海翱艺仪器有限公司产品;电热恒温培养箱:上海善志仪器设备有限公司产品;多功能酶标仪:美国Bio-Tek有限公司产品;Artp-iisARTP诱变系统:无锡源清天木生物科技有限公司产品;游标卡尺(0 150 mm):桂林广陆数字测控股份有限公司产品。葡萄糖、胰蛋白陈、牛肉膏、CH.COONa、吐温80、Na C l、亚硝基胍、丙酮等:国药化学试剂有限公司产品。1.2高抑菌活性诱变菌株的选育1.
14、2.1抑菌活性的测定以大肠杆菌作为指示菌,采用牛津杯法测定植物乳杆菌抑菌活性。首先将大肠杆菌接种至LB液体培养基中,37、2 50 r/min培养12 h,制备菌液。然后将待测菌株接种至MRS食品5生物技术学报2 0 2 3年第4 2 卷第9 期21RESEARCHARTICLEMAO Yin,et al:Breeding of Lactobacillus plantarum with High AntibacterialActivityBased onCompoundMutagenesis培养基中,37、2 50 r/min培养2 4 h,制备发酵液,随后12 0 0 0 r/min离心10
15、 min制备发酵上清液,用于抑菌活性测定。通过双层LB培养基测定菌株的抑菌活性,控制上层半固体培养基中大肠杆菌的菌体浓度为1x10CFU/mL。在此基础上等距离摆放牛津杯(4 5个)后放置在水平台面上凝固。然后在牛津杯中加人待测的发酵上清液2 0 0 L,37培养15h后测量上清液对指示菌产生的抑菌圈直径,每次测定做3组平行。1.2.2常压室温等离子体(ARTP)诱变菌悬液的制备:将植物乳杆菌在37、2 50 r/min培养12 h,12000r/min离心10 min收集菌体并用生理盐水清洗3次,最后稀释成1x107CFU/mL的菌悬液。ARTP诱变:取10 L菌悬液涂在金属载片上,将其放人
16、ARTP诱变系统操作室,控制功率10 0 W,气流量为10 L/min,照射距离为2 mm。诱变结束后,将载片移至装有生理盐水的离心管内,迅速振荡样品。将诱变后的菌悬液涂布于MRS平板上,待长出单菌落后测定平板菌落数,以未处理的菌悬液作为对照,计算致死率 17 ,每组实验3个平行:F=NNmx100%N。式中:F为致死率,%;N。为对照平板菌落数;Nm为诱变平板菌落数。1.2.3亚硝基胍(NTG)诱变NTG母液的配备:取0.02gNTG加人1mL丙酮配制成质量浓度为2 0 gL的NTG母液,再用磷酸缓冲液稀释至NTG质量浓度为2 g/L。NTG诱变:在1mL的植物乳杆菌菌悬液中加人适量的NTG
17、溶液和磷酸缓冲液,控制NTG的终质量浓度分别为0.2 50.50、0.7 5、1.0 0 mg/mL,混合均匀后放置在37、2 50 r/min的摇床中振荡处理30min,6000r/min离心10 min收集菌体并用磷酸缓冲液清洗3次。将诱变后的菌悬液涂布于MRS平板上,待长出单菌落后测定平板菌落数,以未处理的菌悬液作为对照,计算出NTG的致死率,每组实验测定3组平行。1.2.4复合诱变将ARTP诱变后抑菌圈直径有明显提高的突变菌株作为出发菌株,对其进行NTG诱变,筛选抑菌活性较出发菌株有显著提高的突变菌株。1.2.5诱变菌株的初筛参考Gerez等的方法 18 并稍加修改,通过9 6 孔板法
18、测定植物乳杆菌对大肠杆菌的抑制效果。将诱变后的菌株接种于2 0 0 LMRS培养基中,37、2 50 r/min培养12 16 h。随后转接至9 6 孔板中,接种体积分数为2%,37、250r/min培养2 4 h。通过9 6 孔板法测定植物乳杆菌诱变菌株对大肠杆菌的抑制效果。将50 L大肠杆菌菌悬液(110 CFU/mL)和150 L植物乳杆菌诱变菌株的发酵上清液添加到9 6 孔板中,37、250r/min培养2 4 h后用酶标仪测定OD600m值,以接种大肠杆菌菌悬液于MRS培养基的孔板作为对照组,计算诱变菌株的抑菌率:1-=(1-4)A.100%式中:1为抑菌率,%;A。为实验组在6 0
19、 0 nm处的吸光度;A。为对照组在6 0 0 nm处的吸光度。1.2.6诱变菌株的复筛及遗传稳定性测试以初筛后抑菌率较高的菌株作为筛选对象,将其接种于MRS培养基中,37、2 50 r/min培养2 4 h制备发酵液。采用牛津杯法测定菌株的抑菌活性,以抑菌圈直径为筛选高抑菌活性诱变菌株的唯一标准进行复筛。选取ARTP诱变以及复合诱变复筛后抑菌活(1)性较高的菌株,对其连续传代,用牛津杯法测定每一代菌株的抑菌活性,评估诱变菌株的遗传稳定性。1.3基因组重测序植物乳杆菌DY6和诱变菌株在37、2 50 r/min培养12 h后提取基因组DNA用于全基因组测序,测序工作由上海生工生物工程有限公司完
20、成。首先选择质检合格的基因组DNA制备用于IluminaTM二代测序平台的DNA文库。测序完成后将初始数据进行质量评估后过滤得到高质量的数据,与参考基因组植物乳杆菌WCFS1(NC _0 0 4 56 7.2)进行比对。使用GATK的HaplotypeCaller分析样品和参考基因组之间的基因型差异,并通过DELLY、CNVnator软件对样品的SV、C NV 进行检测。根据参考基因组的注释信息,利用 SnpEff软件对突变进行注释。2结果与分析2.1常压室温等离子体诱变菌株的筛选2.1.1ARTP最佳诱变时间通过ARTP对植物乳杆菌DY6的菌悬液进行诱变处理,将经过不同照射(2)22JOUR
21、NAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023研究论文毛银,等:基于复合诱变选育高抑菌活性植物乳杆菌时间(0、10、2 0、30、4 0 s)的菌悬液分别涂布于MRS平板上,待长出单菌落后进行菌落计数,计算致死率。结果如图1所示,ARTP诱变对植物乳杆菌DY6的致死率随着诱变时间的增加而不断升高,表明该菌株对ARTP诱变非常敏感。当处理时间为2 0 s时,菌株致死率达到9 1.3%;当处理时间达到4 0 s时,平板上无菌株生长。由于菌株的致死率大于9 0.0%时,突变菌株中能有较高的正向突变且回复突变的概率较小U19,故选择A
22、RTP诱变的时间为2 0 s。2.1.2ARTP诱变菌株的初筛将植物乳杆菌DY6的菌悬液在ARTP诱变系统中处理2 0 s后涂布于MRS平板上,37 培养4 8 h挑取单菌落接种于9 6孔板。依据1.2.5中的方法筛选抑菌性能较强的菌株,由于具有抑菌效果的植物乳杆菌上清液的添加,孔板中大肠杆菌的生长受到了抑制,因此实验组孔板的OD600m会低于对照组。据此,通过公式(2)计算各菌株的抑菌率,筛选抑菌率大于野生型菌株6260591059075%/本604530150Fig.1 Fatality rate curve of ARTP mutation system(DY6)的诱变菌株,将其编号为A
23、1A62(见图2)。在所有正突变菌株中,菌株A4、A 2 8、A 55的抑菌率有显著提高,分别为6 1.4 8%、59.4 8%、6 0.0 2%。10图1ARTP诱变致死率20诱变时间/s304057565554012345AAA图2 ARTP诱变菌株的初筛Fig.2 Preliminary screening of ARTP mutant strains17抑菌圈直径抑菌活性变化率筛选取抑2.1.3高抑菌活性ARTP诱变菌株的复筛菌性能优良的A4、A 2 8、A 38、A 4 5、A 55共5株诱变菌株,通过牛津杯法测定其抑菌活性进行菌株复筛。结果如图3所示,5株诱变菌株的抑菌活性均高于野
24、生型菌株(DY6)。其中菌株A4和A55的抑菌圈直径较大,抑菌活性相对于野生型植物乳杆菌DY6分别提高了16.38%和14.4 7%。因此,后续研究中选择菌株A4作为复合诱变菌株。8AAAAAAAAAAAA66菌株18工工151612156143130DY6A4A28A38A45A55菌株图3ARTP诱变菌株的复筛Fig.3 Rescreening of ARTP mutant strains食品5生物技术学报2 0 2 3年第4 2 卷第9 期23RESEARCHARTICLEMAO Yin,et al:Breeding of Lactobacillus plantarum with Hig
25、h AntibacterialActivityBased onCompoundMutagenesis2.2复合诱变菌株的选育2.2.1NTG诱变剂量优化与ARTP诱变一致,在进行NTG复合诱变前,首先需要确定NTG的最佳处理剂量。依照1.2.3中的方法,向待诱变菌株菌悬液中加人不同体积的NTG母液,控制其终质量浓度分别为0.2 5、0.50.0.7 5、1.0 0 mg/mL,以未添加NTG的菌悬液作为对照,反应后涂布于MRS平板上,计算NTG对植物乳杆菌的致死率。结果如图4 所示,随着菌悬液中NTG质量浓度的增加,致死率也逐渐上升。当使用0.50 mg/mLNTG处理植物乳杆菌时,菌株的致死
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