基于高效液相色谱指纹图谱及多模式化学计量学分析评价菝葜饮片的质量.pdf
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1、2738Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期基于高效液相色谱指纹图谱及多模式化学计量学 分析评价菝葜饮片的质量陈彦洁1,2,蒋学青1,2,罗鑫1,2,蒋佳丽1,2,王艺洁1,2,谢谭芳1,2,王志萍1,2*(1.广西中医药大学药学院,南宁530200;2.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室,南宁530200)摘要:目的建立不同来源的菝葜高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,结合多模式化学计量学分析菝葜饮片的质量。方法建立 18 批菝葜 HPLC指纹图谱,结合相似度评价、聚类
2、分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析对不同来源的菝葜进行评价。结果指纹图谱标定了 13个共有峰,指认出 5 个成分,分别为绿原酸、落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷及白藜芦醇;相似度评价结果,18 批样品除 YP3 以外,其余相似度均大于 0.9;结合多模式化学计量学分析可以将18 批样品分为三类,并筛选出 6 个可能导致菝葜质量差异的标志物。结论本研究建立的指纹图谱方法简便、重复性好,结合多模式化学计量学分析可用于评价不同来源的菝葜质量。关键词:菝葜;高效液相色谱;指纹图谱;聚类分析;主成分分析;正交偏最小二乘-判别分析中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1672-2981(2023
3、)10-2738-06doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.030Quality evaluation of Smilax china L.by combined HPLC fingerprint and chemical pattern recognitionCHEN Yan-jie1,2,JIANG Xue-qing1,2,LUO Xin1,2,JIANG Jia-li1,2,WANG Yi-jie1,2,XIE Tan-fang1,2,WANG Zhi-ping1,2*(1.School of Pharmacy,Guangxi University o
4、f Chinese Medicine,Nanning 530200;2.Key Laboratory of Generic Technology Research and Development of Traditional Chinese Medicine Preparations in Colleges and Universities in Guangxi,Nanning 530200)Abstract:Objective To evaluate the quality of Smilax china L.from different sources by combined HPLC f
5、ingerprint and chemical pattern recognition.Methods HPLC fingerprints of 18 batches of Smilax china L.were established.Similarity evaluation,cluster analysis,principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis were conducted to evaluate Smilax china L.from differe
6、nt sources.Results Thirteen common peaks were identified and five components were confirmed,namely chlorogenic acid,astiltin,quercetin,engeletin and resveratrol.The similarity evaluation showed that the similarity of 18 batches of samples was greater than 0.9 except YP3.Combined with multi-mode stoi
7、chiometric analysis,the 18 batches of samples were divided into three categories,and 6 quality markers of Smilax china L.were selected.Conclusion The fingerprint method is simple and reproducible,and can be used to evaluate the quality of Smilax china L.from different sources in combination with mul
8、ti-mode stoichiometric analysis.Key words:Smilax china L.;HPLC;fingerprint;cluster analysis;principal component analysis;orthogonal partial least squares-discriminant analysis基金项目:广西科技重大专项(No.桂科 AA18126003)。作者简介:陈彦洁,男,硕士研究生,主要从事中药、民族药新制剂与新剂型的研发,email:*通信作者:王志萍,女,硕士研究生导师,教授,主要从事中药民族药新制剂与新剂型的研究,email:
9、菝葜为百合科植物菝葜 Smilax china L.的干燥根茎,具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效1。现在研究表明,菝葜中主要含有甾体皂苷类、黄酮类、氨基酸类、甾醇类和有机酸类等2739中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 化合物2,具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂3等多种药理作用,临床上可用于治疗肿瘤、慢性盆腔炎、乳腺增生、卵巢囊肿等4-5疾病。中药组成复杂,用单一的指标难以分析评价其综合质量,中药指纹图谱技术是评价中药整体性、稳定性的一种有效方法,从整体上体现中药的化学
10、特征,符合中医理论中全面性、整体性的特点,已成为控制天然药物整体质量的有效手段6。多模式化学计量学分析主要包括聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)等,能从整体上对药材进行评价7。指纹图谱技术结合多模式化学计量学分析能反映出中药材质量与化学组成的真实情况8,基于此,本研究收集了 18 批不同来源的菝葜饮片,建立了菝葜饮片的 HPLC指纹图谱,并结合聚类分析、主成分分析及 OPLS-DA,综合评价菝葜饮片的质量,以期为菝葜的质量控制提供参考。1仪器与试药1.1仪器岛津 LC-2030 Plus型高效液相色谱仪(日本岛津公司);XSR205DU/A型电子天平(美国 Met
11、tler Toledo公司);KQ-800DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UPH-IV20TN型优普超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。1.2试药 绿 原 酸(批 号:MUST-22111711,纯 度:99.82%)、落新妇苷(批号:MUST-22032404,纯度:98.14%)、白藜芦醇(批号:MUST-21112413,纯度:99.82%)、黄杞苷(批号:MUST-22011202,纯度:98.10%)、槲皮苷(批号:MUST-20121401,纯度:98.87%)(成都麦德生科技有限公司);色谱纯乙腈、甲醇(美国 Fisher公司);色谱纯磷酸 阿拉丁试剂(上海)
12、有限公司;其余试剂均为分析纯(成都市科隆化学品有限公司)。本研究收集了包括安徽、江西、贵州、广西、广东及湖南等地的 18 批菝葜饮片,饮片均由广西中医药大学田慧教授鉴定为百合科植物菝葜 Smilax china L.的干燥根茎,样品信息详见表 1。2方法与结果2.1溶液的制备2.1.1供试品溶液的制备取菝葜饮片粉末(过2 号筛)约 0.5 g,精密称定,置 50 mL具塞锥形瓶中,加入 70%甲醇 25 mL,超声(320 W,40 kHz)45 min,放冷,补足质量,摇匀,过 0.45 m 微孔滤膜,取续滤液即得。表 1菝葜饮片来源信息 Tab 1Sample information of
13、 Smilax china L.编号产地批号编号产地批号YP1安徽 1220724YP10广西 1220719YP2安徽 2230201YP11广西 2221001YP3安徽 3221029YP12广西 3230515YP4江西 1220622YP13广东 1220801YP5江西 2220815YP14广东 2220815YP6江西 3210925YP15广东 3230215YP7贵州 1221001YP16湖南 1220615YP8贵州 2221201YP17湖南 2220824YP9贵州 3230217YP18湖南 32212102.1.2混合对照品溶液的制备取落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇
14、、绿原酸及槲皮苷对照品适量,精密称定,加 70%甲醇溶解并定容至刻度,制成质量浓度分别为 0.420、0.190、0.260、0.666、0.206 mgmL 1的混合对照品溶液。2.2HPLC 指纹图谱的建立与分析2.2.1 色 谱 条 件Shim-pack GIST C18 色 谱 柱(4.6 mm250 mm,5 m);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0 25 min,9%A;25 110 min,9%29%A;110 115 min,29%9%A;115 120 min,9%A);流速:1 mLmin 1;柱 温:35;检 测 波 长:302 nm;进样量:10
15、 L。2.2.2精密度试验取菝葜饮片(YP1)0.5 g,按“2.1.1”项下条件制备,再按“2.2.1”项下色谱条件连续进样分析 6 次,以 5 号峰(落新妇苷)为参照峰 S,计算得到各共有峰的相对保留时间RSD 0.39%,相对峰面积 RSD 2.3%,表明仪器的精密度符合指纹图谱要求。2.2.3重复性试验取菝葜饮片(YP1)0.5 g,平行 6 份,按“2.1.1”项下条件制备,再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析,以 5 号峰(落新妇苷)为参照峰 S,计算得到各共有峰的相对保留时间RSD 1.6%,相对峰面积 RSD 2.7%,表明该方法重复性良好。2.2.4稳定性试验取菝葜饮片(Y
16、P1)0.5 g,按“2.1.1”项下条件制备,再按“2.2.1”项下色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12、24 h进样分析,以5 号峰(落新妇苷)为参照峰 S,计算得到各共有峰的相对保留时间 RSD 0.57%,相对峰面积RSD 1.5%,表明供试品溶液在 24 h内稳定。2.2.5指纹图谱的建立及相似度评价取 18 批菝葜饮片,按“2.1.1”项方法制备,再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析,记录色谱图,导入到中2740Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期药色谱指
17、纹图谱相似度评价系统(2012 版),将编号为 YP1 的样品设为参照图谱,用中位数法将各批次样品计算出的数据进行峰匹配生成指纹图谱共有模式,标定了 13 个共有峰,结果见图 1。相似度计算公式如下9-10,式中 xi和 yi分别代表两组样品的共有峰峰面积。18 批菝葜饮片图谱与对照图谱相比,除 YP3 以外,其余相似度均大于0.9(见表 2),表明 18 批不同来源的菝葜饮片一致性较好,可以用于评价菝葜饮片的综合质量。相似度Xi yi Xi yi图 118 批菝葜饮片 HPLC 叠加图谱Fig 1HPLC fingerprint of 18 batches of Smilax china L
18、.表 218 批菝葜饮片的相似度 Tab 2Similarity of 18 batches of Smilax china L.编号相似度编号相似度YP10.941YP100.987YP20.905YP110.963YP30.895YP120.952YP40.917YP130.990YP50.951YP140.971YP60.957YP150.970YP70.919YP160.970YP80.937YP170.978YP90.907YP180.9242.2.6共有峰指认通过与已知混合对照品溶液色谱图比较保留时间,结果见图 2 3,13 个共有峰共指认出 5 个峰,其中峰 2 为绿原酸,峰 5
19、 为落新妇苷,峰 8 为槲皮苷,峰 9 为黄杞苷,峰 10 为白藜芦醇。2.2.7聚类分析以 18 批菝葜饮片共有峰峰面积为变量,经 Z 标准化处理后导入 SPSS 25.0 软件,采用系统聚类中组间连接的聚类方法,以平方欧氏距离为区间,进行聚类,共聚为三类,其中 YP1YP3聚类一类,YP7YP10聚为一类,YP4 6、YP11 18 聚为一类,结果见图 4。2.2.8主成分分析以 18 批菝葜饮片共有峰峰面积为变量,经 Z标准化处理后导入 SPSS 25.0软件,通过降维的手段进行主成分分析,结果Bartlett 球形度检验 P 0.01,表明主成分分析模型成立,以特征值 1 提取了 3
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