【生物医学】-基础与临床北京大学临床肿瘤学院.ppt
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1、p53基因治疗的基础与临床研究基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院北京大学临床肿瘤学院张珊文张珊文2007年年11月月 P53基因基因结构:结构:p53基因定位于人染色体基因定位于人染色体17p13.1区位,区位,全长全长1620kb,有有11个外显子和个外显子和10个内含子,个内含子,分子量为分子量为53KD的磷酸核蛋白,含的磷酸核蛋白,含393个氨基个氨基酸。酸。功能:具功能:具转录因子转录因子的功能。野生型的功能。野生型p53具细具细胞周期检查点功能,使受损细胞阻滞于胞周期检查点功能,使受损细胞阻滞于G1期期(或(或G2期)并引导细胞凋亡。突变型期)并引导细胞凋亡。突变型p53即
2、即丧失该功能,起癌基因作用。丧失该功能,起癌基因作用。p53p53基因染色体定位基因染色体定位p53p53基因结构基因结构功能:基因组保护神功能:基因组保护神 第一部分研究第一部分研究 p53对人胃癌细胞放射对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性的作用敏感性和热敏感性的作用 国家自然科学基因课题(国家自然科学基因课题(95规划)规划)4种种不不同同p53状状况况胃胃癌癌细细胞胞4Gy剂剂量量照照射射后后,仅仅wtp53细细胞胞出出现现了了明明显显的的G1期期阻阻滞滞(分分别别占占原原细细胞胞总总数数的的67.967.9和和61.161.1),和和细细胞胞凋凋亡亡(比比例例分分别别达达13.0%和和1
3、5.3%)。而而其其他他3种种p53异异常常的的细细胞胞都都没没有有出出现现明明显显的的G1期阻滞和凋亡效应。期阻滞和凋亡效应。4种胃癌细胞种胃癌细胞4Gy照射后照射后w细胞、细胞、M细胞、细胞、neo细胞和细胞和823细胞生存率分别为细胞生存率分别为0.108 0.006、0.155 0.004、0.147 0.007和和0.140 0.013,W细胞生存率显著地低于后三种细胞细胞生存率显著地低于后三种细胞(p0.05)4种胃癌细胞肿瘤种胃癌细胞肿瘤10Gy照射后体积抑制曲线:照射后体积抑制曲线:w细胞肿瘤放射反应曲细胞肿瘤放射反应曲线明显受到抑制线明显受到抑制p53对人胃癌细胞热敏感性的作
4、用对人胃癌细胞热敏感性的作用4 4种不同种不同p53p53状况胃癌细胞在状况胃癌细胞在4242C C 2 h2 h 或或4343C 30minC 30min后后8 8h h,仅,仅W W细细胞胞S S期比例明显增加期比例明显增加(P0.05P0.05)分分别占别占53.553.5或或50.050.0,凋亡比率凋亡比率分别达分别达10.5%10.5%和和12.3%12.3%。而其他。而其他3 3种种细胞的细胞的S S期比例无明显增高期比例无明显增高 ,凋,凋亡比例都为亡比例都为0(0(p0.05)p0.05)。4 4种细胞种植肿瘤两次种细胞种植肿瘤两次43C 20min加热后,加热后,w细胞细胞
5、肿瘤抑制曲线增长缓慢,到肿瘤抑制曲线增长缓慢,到20天时仅增大了天时仅增大了1倍倍,而其他而其他3种细胞肿瘤增长迅速,到种细胞肿瘤增长迅速,到20天时增大了天时增大了2.7 3.6倍倍,生长速度显著地高于生长速度显著地高于W细胞细胞(P0.05)。第二部分研究第二部分研究重组人重组人p53腺病毒对人胃癌细胞腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性作用放射敏感性和热敏感性作用作用机制作用机制Bax凋亡凋亡坏死坏死重组腺病毒颗粒重组腺病毒颗粒重组腺病毒颗粒重组腺病毒颗粒激活免疫系统激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫力提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫力免疫
6、系统免疫系统作用机制作用机制转染率与病毒剂量转染率与病毒剂量 病毒量为病毒量为50 MOI时,四种胃癌细时,四种胃癌细胞感染率胞感染率40%左右;左右;100 MOI时,时,感染率达感染率达8090%(multiplicity of infection,MOI,效靶比)。效靶比)。Adp53表达定位表达定位1:100MOI效靶比效靶比Adp53产生产生细胞高转染率(细胞高转染率(100)和)和p53基因在基因在细胞内高表达细胞内高表达,产,产生生G2/M期阻滞和凋亡增加和期阻滞和凋亡增加和细胞增殖抑制细胞增殖抑制图图1 100MOI Adp53感染感染4种种胃癌胃癌细细胞胞48小小时时后后p5
7、3蛋白的蛋白的免疫免疫组组化染色。化染色。Adp53感染感染细细胞核着棕色。胞核着棕色。显显示示p53表达在表达在细细胞核内并达胞核内并达到到100转转染。染。1.Marker 2.W+Adp53 3.W control 4.M+Adp53 5.M control 6.neo+Adp53 7.neo control 8.823+Adp53 9.823 control图图2:Western blot印印记记法法显显示示4种胃癌种胃癌细细胞胞100MOIAdp53感染感染后后48小小时时,在,在53KD位置上均有位置上均有一条清晰的一条清晰的杂杂交交带带,表明,表明 p53蛋蛋白高表达。白高表达。
8、Wt Mut Neo BGC-823图图3.4种胃癌种胃癌细细胞胞100MOIAdp53感染后感染后48小小时时TUNEL法染色法染色显显示示高比率凋亡高比率凋亡细细胞被染成棕胞被染成棕色。色。表表1 Adp53结结合合4Gy照射胃癌照射胃癌细细胞存活率胞存活率 存活分数存活分数 细细胞系胞系 Ad-p53组组 4Gy组组 p53+4Gy组组 Wtp53 0.6260.019 0.1170.013 0.0940.001 Mutp53 0.3690.024 0.1690.002 0.0760.009 Neo 0.5180.016 0.1520.004 0.1100.005 823 0.5260.
9、023 0.1500.005 0.1080.025 注:采用Hotelling T2 检验表明Ad-p53+4Gy组存活分数显著低于4Gy组(P0.001)Adp53结合放射实验结合放射实验 表表2 Adp53结结合合4Gy照射照射对对4种胃癌种胃癌细细胞的胞的细细胞周期和凋亡的影响(胞周期和凋亡的影响(FCM法)法)细细胞系胞系 条件条件 G1 S G2/M Sub-G1 凋亡率比凋亡率比值值Wtp53 对照组 48.25.0 29.64.0 22.24.0 4.91.1 Adp53 43.612.0 31.810.5 24.616.5 10.61.6 4Gy 61.04.2 25.19.9
10、 13.97.5 13.42.0 Adp534Gy 41.512.0 21.76.5 36.8 15.5 39.9 5.0 3.0#Mutp53 对照组 48.512.0 39.55.5 12.010.0 5.52.0 Adp53 40.32.0 38.716.0 21.010.0 17.93.2 4Gy 40.514.0 44.516.0 14.03.0 12.74.0 Adp534Gy 34.84.0 34.316.5 30.8 11.0 45.5 10.0 3.6Neo 对照组 44.05.0 33.36.5 22.75.0 7.02.5 Adp53 39.25.5 34.76.5 26
11、.17.5 18.02.9 4Gy 43.09.0 30.27.5 26.86.5 11.45.0 Adp534Gy 29.78.0 36.27.5 34.1 9.5 25.1 2.5 2.2823 对照组 52.03.0 34.85.5 13.24.0 5.13.0 Adp53 42.54.0 39.82.0 21.66.0 15.84.8 4Gy 53.612.5 29.510.5 16.92.0 11.83.0 Adp534Gy 40.82.5 1.39.0 27.9 7.0 29.8 6.3 2.5 表表3 Adp53结结合合4Gy照射照射4种胃癌种胃癌细细胞的凋亡率胞的凋亡率(TUN
12、EL法法)凋亡率(凋亡率(%)细细胞系胞系 对对照照组组 Ad-53 4Gy p53+4Gy 凋亡率比凋亡率比值值 Wt-p53 1.0 18.0 0.5 12.0 2.0 40.0 2.5 3.3*Mut-p53 0.0 28.0 2.0 3.0 1.0 48.0 3.5 16.0 Neo 0.0 26.0 3.0 5.5 0.5 36.0 0.5 6.5 BGC823 0.0 25.0 4.0 5.0 1.0 35.0 1.5 7.0 *凋亡率比凋亡率比值值Adp534Gy的凋亡率的凋亡率/单纯单纯4Gy的凋亡率的凋亡率nW细胞肿瘤细胞肿瘤Adp53对对6Gy照射的抑瘤率比值为照射的抑瘤率
13、比值为1.41,而而对对M细胞肿瘤为细胞肿瘤为1.91。图图5.2示示Adp53结合结合6Gy照照射对射对M细胞肿瘤的抑制作用细胞肿瘤的抑制作用 图图5.1示示Adp53结结合合6Gy照照射射对对W细胞肿瘤的抑制作用细胞肿瘤的抑制作用相对体积相相对对体体积积 表表1 Adp53结结合加温合加温对对W细细胞周期和凋亡的作用(胞周期和凋亡的作用(FCM)条件条件 G1 S G2/M Sub-G1 热热增效比增效比对照 38.76.2 39.37.3 22.01.6 2.61.7Adp53 38.52.4 26.82.7 34.71.0 8.50.742C 2h 36.85.0 37.83.9 25
14、.36.0 6.54.843C 0.5h 42.07.1 34.04.7 24.04.3 14.212.2Adp53+42C 2h 44.85.1 21.86.7 34.0 2.9 21.4 9.8 3.3Adp53+43C0.5h 35.82.1 40.57.6 23.8 7.1 22.5 12.2 1.6 表表2 Adp53结结合加温合加温对对M细细胞周期和凋亡的作用(胞周期和凋亡的作用(FCM)条件条件 G1 S G2/M Sub-G1 热热增效比增效比对照 45.81.5 34.80.5 20.00.8 2.21.5Adp53 41.32.4 33.56.2 25.87.8 8.25.
15、242C 2h 41.35.0 36.512.2 22.05.9 4.71.543C 0.5h 43.83.9 38.54.7 17.55.1 7.512.2Adp53+42C 2h 42.510.8 32.03.3 25.3 13.4 9.8 2.4 2.1Adp53+43C0.5h 41.52.5 36.39.9 22.5 12.5 13.3 0.5 1.8 时间(天)时间(天)图图6.1 Adp53结合结合43 C0.5h W细细胞肿瘤抑制曲线胞肿瘤抑制曲线 时间(天)时间(天)图图6.2 Adp53结合结合43 C0.5h W细细胞肿瘤抑制曲线胞肿瘤抑制曲线相相对对体体积积 W细胞种植
16、肿瘤相对生长曲线细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图见图6.1):单纯:单纯43 C 0.5h加温、单纯加温、单纯Adp53和和Adp53结合结合43 C 0.5h,肿瘤抑制率分别为,肿瘤抑制率分别为15.8%、21.8%和和27.2%,Adp53的热增效比为的热增效比为1.7。M细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图6.2):单纯加温、单纯):单纯加温、单纯Adp53和和Adp53结合加温,肿瘤抑制率分别为结合加温,肿瘤抑制率分别为24.2%、31.0%和和37.8%,Adp53的热的热增效比为增效比为1.6。临床研究临床研究Gene Therapy dreamp53 基因放
17、疗基因放疗 野生型野生型p53p53促进放射线引发的细促进放射线引发的细胞周期阻滞和凋亡。而变异胞周期阻滞和凋亡。而变异p53 p53 减弱甚至取消这种效应减弱甚至取消这种效应腺病毒介导腺病毒介导p53p53恢复肿瘤细胞内恢复肿瘤细胞内p53p53的功能,提高肿瘤细胞放射的功能,提高肿瘤细胞放射敏感性。敏感性。试验材料试验材料重组人重组人p53腺病毒注射液(今又生)腺病毒注射液(今又生)今又生结构:今又生结构:E1基因缺失的携带人野基因缺失的携带人野生型生型p53基因的基因的5型腺病毒型腺病毒Adp53 structure Gendicine is an E1 substituted repl
18、ication-incompetent recombinant adenovirus encoding the human p53 gene.E1A/E1Bdeletionp53Structural proteinsE4E2E3病毒表面的蛋白质与细病毒表面的蛋白质与细胞表面的蛋白质通过胞表面的蛋白质通过“配子与配体配子与配体”结合的方结合的方式,整个病毒颗粒被细式,整个病毒颗粒被细胞吞噬入细胞内。在细胞吞噬入细胞内。在细胞浆内,病毒外壳与内胞浆内,病毒外壳与内核的核的DNA分离,其中外分离,其中外壳蛋白质被降解;壳蛋白质被降解;DNA进入细胞核。在核内,进入细胞核。在核内,DNA转录出转录出R
19、NA(mRNA),mRNA从胞核出来进入细胞浆;从胞核出来进入细胞浆;在胞浆翻译出在胞浆翻译出 p53蛋白蛋白质质,p53蛋白质通过内蛋白质通过内质网系统再进入到细胞质网系统再进入到细胞核与核内的核与核内的DNA结合,结合,以调节以调节DNA(基因)表基因)表达。达。P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生瘤内注射今又生p53基因及其靶基基因及其靶基因的表达因的表达治疗治疗P53基因基因上调上调P21基因及基因及Bax基因基因下调下调VEGF基因基因方法:方法:IHC和和RTPCR及测序及测序免疫组化法评价今又生瘤内注射后免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达基因表达.张子苑张子苑NPC例
20、,注药前例,注药前p53Adp53注射后注射后p53+75%刘凯恶性神经鞘瘤例刘凯恶性神经鞘瘤例 注药前注药前P53+75%,PCR+P53基基因因表表达达张沂择舌癌例,注药前张沂择舌癌例,注药前P21张沂择注药后张沂择注药后P2150丁先进丁先进NPC例,注药前例,注药前P21丁先进注药后丁先进注药后P21 25P21基基因因表表达达丁先进丁先进NPC,注药前,注药前Bax丁先进注药后丁先进注药后Bax2550郑昌华郑昌华NPC例,注药前例,注药前Bax郑昌华例注药后郑昌华例注药后Bax50%张沂择例注药后张沂择例注药后Bax25-50张沂择舌癌例注药前张沂择舌癌例注药前Bax丁先进丁先进N
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