基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异.pdf
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1、673基础研究ExperimentalResearch中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen Surg基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异俊数魏利敏王王光辉余军军孙祺西安交通大学第一附属医院完普通外科4(陕西西安7 10 0 6 1)【摘要】目的:对结肠癌肝转移和肝外卵巢转移的患者进行二代转录组测序,比较转移灶与正常组织RNA表达谱的差异,寻找转移灶的分子差异与作用位点。方法:对1例合并肝与和盆腔转移的回盲部结肠癌患者的结肠上皮与肝、卵巢转移组织进行测序分析,筛选出不同转移灶之间
2、的差异表达基因并进行功能富集分析。结果:与正常组织相比,肝转移灶中差异表达基因12 0 6 4个,卵巢转移灶中差异表达基因12 2 6 5个。KEGG功能分析发现转移灶的差异基因主要富集于癌症与PI3K-AKT通路。肝转移灶FZD9、RET、I FNG 等基因显著差异表达,卵巢转移灶WNT2、W NT 7 B、I FNG 等基因显著差异表达。结论:转录测序发现该患者转移与正常组织间差异基因主要富集于癌症通路,其中FZD9、I FNG、W NT 2 等差异表达基因可能与结肠癌转移相关。【关键词】结肠癌远处转移转录测序KEGG功能分析【中图分类号】R735.35【文献标识码】Adoi:10.396
3、9/j.issn.1009-9905.2023.09.001【文章编号】10 0 9-990 5(2 0 2 3)0 9-0 6 7 3-0 5Molecular mechanism differences between liver metastasisand ovarian metastasis of colon cancer based on second-generation sequencing technologyYAN Jun,WEILi-min,WANG Guang-hui,SHE Jun-jun,SUNQiDepartment of General Surgery,the F
4、irst Affiliated Hospital of Xian Jiaotong Universi-ty(Xian 710061,China)ABSTRAcT】O b je c t iv e:T r a n s c r ip t o m e s e q u e n c in g W a s p e r fo r m e d o n a n p a t ie n t s s u ffe r e d fr o mcolon cancer with liver and extrahepatic pelvic metastases,and the differences in RNA express
5、ionprofiles between metastases and normal tissues were compared to find the molecular differences.Methods:A rare ileocecal colon cancer patient with liver and pelvic metastases was sequenced toscreen out differentially expressed genes(DEGs)in metastases and functional enrichment analysis【基金项目国家自然科学基
6、金资助项目(8 17 0 2 36 2)【作者简介】阎俊(1995),男,甘肃庆阳人,博士研究生,研究方向:普通外科相关疾病的临床及基础研究。E-mail:通信作者】孙祺(198 7 ),男,山东人,副研究员,研究方向:普通外科疾病临床及基础研究。E-mail:s u n q i 48 7 5 16 3.c o m中国现代普通外科进展2 0 2 3年9 月第2 6 卷第9 期was employed.Resaults:Compared with normal tissue,12064 DEGs were found in liver metas-tases and 12265 DEGs wer
7、e found in ovarian metastases.KEGG functional analysis showed thatcancer and PI3K-AKT pathways were enriched mostly.FZD9,RET,IFNG were significantly differen-674tially expressed in liver metastases,and WNT2,WNT7B,IFNG were significantly differentially ex-pressed in ovarian metastases.Conclusion:Tran
8、scriptome sequencing of the patient found thatthe DEGs between the metastatic and normal tissues were mainly enriched in pathway in cancer.FZD9,IFNG,WNT2 and other DEGs may be related to tumor metastasis.【K EYW O RD S】Co l o n c a n c e r Distant metastasisRNA sequencingKEGGfunction统计显示约2 0%的结直肠癌患者在
9、首诊时已发生转移,40%的患者经治疗后出现复发或转移 1。远处转移是患者预后不良的重要危险因素,结直肠癌的5年生存率约为6 5%,但转移性结直肠癌的5年生存率仅为14%,发生多器官转移时不到5%2-3。同时,非孤立性远处转移患者数量少,现有文献鲜有报道。因此,进一步阐释结肠癌的转移机制,探索肿瘤转移的作用位点,对于改善转移性结直肠癌患者的预后具有重要的意义。本研究通过对1例结肠腺癌伴肝脏、盆腔转移患者的组织样本进行RNA测序,筛选出与肝转移及子宫卵巢转移相关的差异表达基因,对差异基因进行功能分析,探究可能参与结直肠癌远处转移及影响器官转移特异性的潜在基因与作用靶点。1材料和方法1.1材料2 0
10、 2 1年西安交通大学第一附属医院普通外科院收治1例49 岁女性患者,结肠镜检示回盲部隆起性病变,经病理检测为结肠腺癌,术前进行全腹部增强CT检查考虑肝脏、盆腔转移。行腹腔镜辅助右半结肠切除术+盆腔转移癌切除术+全子宫、双附件切除术+肝部分切除术。术前与患者及家属沟通并签署标本留取知情同意书。术中待组织切除取出后,解剖组织,留取癌旁上皮组织及转移病灶处组织标本,干冰运输,-8 0 保存。1.2转录组测序送检标本包括正常组织(normaltissue,NT)、肝转移组织(liver metastases,LM)和卵巢转移组(ovarian metastases,OM)。使用 Trizol 试剂盒
11、分别提取NT组、LM组、OM组组织的总RNA后,分别用NanoPhotometer分光光度计检测样品纯度,用Agilent 2100 RNANano 6000AssayKit 检测RNA样品的完整性和浓度。检测样品合格后,纯化mRNA,构建文库,并使用Agilent2100生物分析仪对文库进行质检。检测质量合格后,文库由北京安诺优达基因科技有限公司基于Illumina平台,通过PE150测序策略,进行测序。1.3测序数据过滤Illumina平台测序得到原始下机序列(RawReads)后,对RawReads进行过滤。数据处理步骤如下:(1)去除接头污染的Reads;(2)去除低质量的Reads;
12、(3)去除含N比例大于5%的Reads。过滤后获到高质量的序列(Clean Reads),经质控合格后,基于CleanReads进行数据比对分析和转录组深层分析。1.4差异表达基因分析通过DESeq2进行基因差异表达的分析,差异表达基因的筛选主要以差异倍数(Fold change)以及q值(矫正后P值)为参考。差异基因的筛选标准定为llog2 Fold changel1 和q0.05。1.5功能分析对差异基因进行GO数据库的富集及功能分析。GO共有3个亚层,分别描述基因参与的生物过程、细胞组分、分子功能。使用KEGG数据库对差异基因进行通路分析。该数据库可以对蛋白质交互网络在各种各样的细胞活动
13、过程起的作用做出预测。1.6统计学处理采用R软件。数据采用xs表示,组间比较采用t检验进行,多组间比较采用ANOVA单因素方差分析,P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1患者术后病理患者术后病理示:“回盲部 结肠溃疡型中分化腺癌,侵及肠壁全层达浆膜下纤维脂肪组织,并由外向内侵及子宫肌壁深肌层及双侧卵巢组织、宫颈。切除肝组织内有中分化腺癌浸润,结构符合结肠癌肝转移。免疫组织化学结果显示,肝:CD20(+),CDX2(+),SATB2(+);子宫:CA125(-),ER(-),PR(-)。2.2转移灶与正常组织基因表达量差异分析RNA测序发现,LM与NT相比,上调基因58 37 个,下调基因
14、6 2 2 7 个。OM与NT相比,上调基因5552 个,下调基因6 7 13个,绘制差异表达基因火山图与层次聚类分析热图。再利用k均值聚类算法,将差异基因分为6 个相近的聚类集合,每个聚类集合中的基因其表达趋势相近。见图1。阎俊,等.基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异2.3差异基因GO功能分析利用GO数据库分析差异表达基因,对其功能进行限定和描述(图2)。GO功能富集分析发现,LM相比NT,差异基因在生物过程部分富集于大分子代谢过程的调节、细胞代谢过程的调节和细胞组织成分等。差异基因在细胞组分部分富集于膜和膜细胞器等。差异基因在分子功能部分富集于结合和离子结合。OM
15、相比NT,其差异基因在生物过程部分富集于细胞进程。差异基因在细胞组分部分富集于膜和膜细胞器等。差异基因在分子功能部分富集于结合和离子结合。2.4差异基因KEGG功能分析利用KEGG数据库分析差异基因富集的信号通路,预测其在各类信号活动中的作用。LM相比NT,差异表达基因主要LM_NT00(Iped)6i-00L涉及137 个代谢通路(图3A),其中最为富集的是癌症通路。此外,PI3K-AKT通路和人乳头瘤病毒感染也是差异基因较为富集的通路。OM相比NT,差异表达基因主要涉及12 9 个代谢通路(图3B),其中最为富集的是癌症通路,之后是PI3K-AKT通路、人乳头瘤病毒感染等。2.5富集通路中
16、的差异基因选择富集程度最高的癌症通路进一步分析。LM与NT相比,该通路中FZD9、G NA S-A S1、RET 等基因上调最显著,而VEGFD、NO S2、CO L4A 5等基因下调最显著。OM与NT相比,该通路中WNT2、EPO、W NT 7 B等基因上调最显著,而NOS2、VECFD、ECF等基因下调最显著。见图4。OM_NTADown008UpNone(Iped)6i-0L675ColorKeyBDownUpNone00C-5.5ValueO-10-5FoldChange(log2)SubClass1,4371genes5263?OL-TTTTT一510-15-10-50510Fold
17、Change(log2)Sub Class 3,828genes5TT63?OL-TTTTTSub Class 5,1720 genesD5263?9-OL-TTTTTSubClass2,1010genes5一269-OL-SubClass 4,6122genes2630?OL-TTTTTSubClass6,2797genes63?OL-TTTTT1图1差异表达基因的火山图、热图、聚类图A、B:LM 与OM相比NT差异基因的火山图,蓝点为显著下调基因,黄点为显著上调基因,灰点为差异不显著基因;C:NT、LM、O M 三处组织差异基因热图;D:差异表达基因的k均值聚类图中国现代普通外科进展202
18、3年9 月第2 6 卷第9 期AEnrichment of molecularfunctioncation binding-transtion metalon bindington binding676protein dimercarbohydrate derivative bindsmallmofecule bindingtranscriptionregulatoractivitycatalytic.activitybindingEnrichment of biological processregulation.of macromoleculeHog(FDR)26.9919.0611.12
19、3.18Sizedrug binding136Enrichment of cellular componentendoplasrmbrane4og(FDR)regulation of celilar metabolic process15.10cellutarcomponeorganizaticregulation.of.transcnption,DNA-teregulation of nucieic acid-templated transcriptionregulation of RnA bios)cellutarcomponent arganization or biogenesisre
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