circ＿0092315通...腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭_柯淑红.pdf

中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE16February，2023基金项目:湖北省自然科学基金(2011CDB300)论著circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭柯淑红1，孔彩霞1，徐瑶2，彭聪1武汉市第一医院1内分泌科2病理科，武汉 430030通信作者:彭聪电话:[phone]，电子邮件:摘要:目的研究 circ_0092315 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其分子机制。方法采用实时荧光定量 PC 方法检测人甲状腺乳头状癌细胞中 circ_0092315 的表达水平，CCK-8 法和 Transwell 实验检测 TPC-1 细胞的增殖和侵袭能力，Western blot 检测高迁移率族蛋白 A2(HMGA2)蛋白表达水平。通过生物信息数据库、双荧光素酶报告基因检测、实时荧光定量 PC、蛋白质印迹法探讨 circ_0092315、微小 NA-1256(mi-1256)和 HMGA2 的靶向调控关系。结果circ_0092315 在人甲状腺乳头状癌细胞中呈现高表达(P 均 0.001)。circ_0092315 促进 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力(P 均 0.001)。转染 circ_0092315 小干扰 NA 可上调 mi-1256 的表达水平(P 0.001)。mi-1256 抑制物上调 HM-GA2 蛋白表达(P 0.001)。结论circ_0092315 在人甲状腺乳头状癌 TPC-1 细胞中呈高表达，通过调控 mi-1256/HM-GA2 轴促进 TPC-1 细胞的增殖和侵袭。关键词:甲状腺乳头状癌;circ_0092315;微小 NA-1256;高迁移率族蛋白 A2中图分类号:581.9文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0016-06DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15026circ_0092315 Promotes Proliferation and Invasion of Papillary Thyroid Carcinoma Cells viaegulating microNA-1256/High Mobility Group A2 axisKE Shuhong1，KONG Caixia1，XU Yao2，PENG Cong11Department of Endocrinology，2Department of Pathology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430030，ChinaCorresponding author:PENG CongTel:027-85332130，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo investigate the role and mechanism of circ_0092315 in the proliferation andinvasion of papillary thyroid carcinoma cells.MethodsThe expression of circ_0092315 in papillary thyroid car-cinoma cells was examined by real-time fluorescence quantitative PC.The proliferation and invasion of TPC-1cells was assessed by CCK-8 and Transwell assays.The protein level of high mobility group A2(HMGA2)wasdetermined by Western blotting.The regulatory relationship of circ_ 0092315，microNA-1256(mi-1256)，and HMGA2 was explored by bioinformatics tools，dual-luciferase reporter assay，real-time fluorescence quanti-tative PC，and Western blotting.esultscirc_ 0092315 was overexpressed in papillary thyroid carcinomacells(all P 0.001).circ_0092315 promoted the proliferation and invasion of TPC-1 cells(all P 0.001)The transfection of si-circ_0092315 up-regulated the expression of mi-1256(P 0.001)，and mi-1256 inhibitorup-regulated the protein level of HMGA2(P 0.001).Conclusioncirc_0092315 is overexpressed in TPC-1circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭Vol.45 No.117cells and it promotes the proliferation and invasion of TPC-1 cells by regulating the mi-1256/HMGA2 axis.Key words:papillary thyroid carcinoma;circ_0092315;microNA-1256;high mobility group A2Acta Acad Med Sin，2023，45(1):16-21甲状腺癌是目前最常见的内分泌肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，占内分泌系统恶性肿瘤的 95%1。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌临床病理分型之一，也是最常见、分化程度高、恶性度小的甲状腺肿瘤2。尽管对其已有许多研究，但甲状腺乳头状癌的发生发展是一个涉及多因素的复杂生物学过程，目前具体发病机制不清。环状 NA(circular NA，circNA)是一类共价闭合环状的内源性非编码 NA，在正常生理活动以及各种疾病进程中具有重要作用3。研究表明circNA 在肿瘤中表达异常且与肿瘤的发生发展密切相关，但 circNA 在甲状腺癌中的功能尚不清楚。最近研究发现，hsa_ circ_0060060 在甲状腺乳头状癌细胞中表达上调，并通过抑制微小 NA(microNA，mi)-144-3p 增加甲状腺癌细胞的顺铂耐药性4。本研究通过生物信息学方法研究 circ_0092315 对甲状腺癌乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探究其潜在的分子机制。材料和方法材料人正常甲状腺细胞 Nthy-ori3-1、人甲状腺乳头状癌细胞 TPC-1、BCPAP、IHH4 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。PMI 1640 培养基、胎牛血清购自美国 Hyclone 公司，TIzol 试剂盒、脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000 购自美国 Invitrogen 公司，反转录和实时荧光定量 PC(real-time fluorescencequantitative PC，qT-PC)试剂盒购自日本 Takara 公司，circ_0092315 小干扰 NA(si-circ_0092315)及小干扰 NA 对照(si-对照)、mi-1256 模拟物及模拟物对照、mi-1256 抑制剂及抑制剂对照、空载质粒、过表达人高迁移率族蛋白 A2(high mobility group A2，HM-GA2)质粒购自上海吉玛制药技术有限公司，兔抗人HMGA2 抗体(货号:ab207301)和 GAPDH 抗体购自美国 Abcam 公司，IPA 裂解液和 BCA 蛋白检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Transwell 小室购自美国Corning 公司，Matrigel 基质胶购自美国 BD 公司。细胞培养及转染人甲状腺乳头状癌 TPC-1、BCPAP、IHH4 细胞在含 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的PMI 1640 培养基中，37、5%CO2恒温培养箱中培养。取对数生长期的 TPC-1 细胞以 1 105个/孔的密度接种于六孔板中，按照 LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书进行转染。根据处理情况将细胞分为 si-circ_0092315 组和 si-对照组、mi-1256 模拟物组和模拟物对照组、mi-1256 抑制剂组及抑制剂对照组、si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组和 si-circ_0092315+抑制物对照组、si-circ_0092315+过表达 HMGA2 组和si-circ_0092315+空载体组。qT-PC 检测采用 Trizol 试剂按说明书提取细胞总 NA，通过反转录试剂盒将总 NA 反转录为 cDNA。在 ABI 7500 定量 PC 仪上完成 qT-PC 扩增，采用2-CT法分别计算目标基因的相对表达量。引物序列:circ_ 0092315 上游引物:5-TGCCAGCATGTAGACCT-CAG-3，下游引物:5-TTGTGAAAATGCCAAGGACA-3;mi-1256 上游引物:5-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3，下游引物:5-TTTAATTACCAACCGAATACG-3;GAPDH上游引物:5-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3，下游引物:5-CGGTGCCATGGAATTTGCC-3;U6 上游引物:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。circ_0092315 基因检测以 GAPDH作为内参，mi-1256 基因检测以 U6 作为内参。细胞增殖实验将转染 si-circ_0092315 的 TPC-1细胞以 2 103个/孔的密度接种于 96 孔板中，分别培养24、48、72 h，每孔加入10 l CCK-8 试剂在37、5%CO2培养箱中孵育 2 h，用酶标仪测定各孔细胞在450 nm 处的光密度(optical density，OD)值。细胞侵袭实验将 10 l Matrigel 基质胶均匀涂在Transwell 小室内面，待基质胶凝固。向24 孔板中加入600 l 含有10%血清的 DMEM 高糖培养基，其内放置Transwell(8 m)小室。向小室内加入转染 si-circ_0092315 或阴性对照的 TPC-1 细胞(2.5 104个/孔)，置于 37、5%CO2恒温培养箱中培养。24 h 后取出小室，用棉签将上室内面的细胞去掉，4%多聚甲醛固定 30 min，0.5%结晶紫染色液染色 15 min，PBS 清洗 3 次，用棉签擦净膜内面未迁移的细胞和染料，在显微镜下拍照，每个孔随机选 5 个视野拍照，并分别计数后求出平均值进行比较。Western blot 检测按照每 1.0 106个 TPC-1 细中 国 医 学 科 学 院 学 报18February，2023胞加入100 l IPA 蛋白裂解液，混匀后置冰上30 min，4 12 000 g 离心 30 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋白含量。将转有蛋白的 PVDF 膜置于 5%脱脂奶粉室温中振荡封闭 1 h，TBST 缓冲液清洗后，加入兔抗人 HMGA2 抗体(11000)4 孵育过夜，清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 2 h，电化学发光法显色，凝胶成像系统扫描分析。双荧光素酶报告基因检测利用 Circular NA Inter-actome 数据库(https:/circinteractome.nia.nih.gov/)预测 circ_0092315 靶基因。将 circ_0092315 的互补结合位点突变，构建突变型(circ_0092315 突变型)和野生型(circ_0092315 野生型)荧光素酶报告载体(广州锐博生物技术有限公司)，并与 mi-1256 模拟物或模拟物阴性对照转染至 TPC-1 细胞中。转染 24 h 后，利用双荧光素酶活性检测试剂盒(Promega 公司，美国)检测荧光素酶活性。统计学处理采用 SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数 标准差表示，两组间比较采用 t 检验;多组间比较采用单因素方差分析，并采用 LSD 检验进行两两比较;多组间不同时间点比较采用重复测量方差分析。P 0.05 为差异有统计学意义。结果人甲状腺乳头状癌细胞 circ_0092315 的表达水平qT-PC 检测结果显示，与人正常甲状腺细胞 Nt-hy-ori3-1 比较，人甲状腺乳头状癌 TPC-1(3.152 0.053 比 0.989 0.007;t=104.977，P 0.001)、BCPAP(2.257 0.041 比 0.989 0.007;t=71.930，P 0.001)、IHH4 细胞(1.859 0.059 比 0.989 0.007;t=37.323，P 0.001)中的 circ_0092315 表达水平显著升高，且在 TPC-1 细胞中表达最高(F=483.233，P 0.001)。circ_0092315 对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响与 si-对照组比较，转染 si-circ_0092315 的 TPC-1 细胞中 circ_0092315 表达水平显著降低(0.486 0.046 比0.990 0.009;t=30.982，P 0.001)。CCK-8 法检测结果显示，si-circ_ 0092315 组的 TPC-1 细胞在 24、48、72 h 的细胞增殖能力显著低于 si-对照组(F=1896.298，P 0.001)，且两组OD 值变化趋势差异有统计学意义(F=1320.688，P 0.001)(图1A)。Transwell 实验检测结果显示，si-circ_0092315 组 TPC-1 细胞的侵袭能力显著低于 si-对照组(37.000 5.121 比 94.100 4.012;t=27.756，P 0.001)(图 1B)。circ_0092315 与 mi-1256 的关系利用 CircularNA Interactome 数据库分析发现，mi-1256 和 circ_0092315 之间存在结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示，mi-1256 模拟物和 circ_0092315 野生型共转染后，与模拟物对照组比较，mi-1256 模拟物组荧光素酶活性显著降低(0.528 0.048 比 0.978 0.009;t=27.889，P 0.001)。与 si-对照组比较，转染 si-circ_0092315 的 TPC-1 细胞 mi-1256 表达水平显著增加(2.126 0.063 比 0.986 0.011;t=51.347，P 0.001)。si-circ_ 0092315 和 mi-1256 抑制物对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响CCK-8 法检测结果显示，si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组 TPC-1 细胞在 24、48、72 h 的细胞增殖能力显著高于 si-circ_0092315+抑制物对照组(F=1690.251，P 0.001)，si-对照+抑制物对照组、si-circ_0092315 组、si-circ_0092315+抑制物对照组和 si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组OD 值变化趋势差异有统计学意义(F=598.694，P 0.001)(图 2A)。Transwell 实验检测结果显示，与 si-对照+抑制物对照组比较，si-circ_0092315 组 TPC-1 细胞迁移能力显著降低(21.100 7.838 比 98.400 1.265，t=30.789，P 0.001);与si-circ_0092315 组比较，A.CCK-8 法检测 si-circ_0092315 对 TPC-1 细胞增殖能力的影响;B.Transwell 实验检测 si-circ_0092315 对 TPC-1 细胞侵袭能力的影响图 1circ_0092315 对人甲状腺乳头状癌 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭Vol.45 No.119si-circ_0092315+抑制物对照组 TPC-1 细胞迁移能力差异 无 统 计 学 意 义(21.000 2.449 比 21.100 7.838，t=0.039，P=0.970);与 si-circ_ 0092315+抑制物对照组比较，si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组 TPC-1 细胞迁移能力显著升高(55.400 3.098比 21.000 2.449，t=27.542，P 0.001)(图 2B)。circ_ 0092315 和 mi-1256 对 HMGA2 表达的影响利用 Targetscan 数据库预测发现 mi-1256 与 HMGA2之间存在结合位点(图 3A)。Western blot 检测结果显示，与模拟物对照组比较，mi-1256 模拟物组 TPC-1细胞 HMGA2 蛋白表达水平显著降低(0.267 0.036比 0.990 0.007;t=51.946，P 0.001);与抑制物对照组比较，mi-1256 抑制物组 TPC-1 细胞 HMGA2 蛋白表达水平显著升高(1.587 0.033 比 0.992 0.007;t=35.866，P 0.001)(图 3B)。与 si-对照组比较，si-circ_0092315 组 TPC-1 细胞 HMGA2 表达下降(0.237 0.036 比 0.990 0.008，t=64.648，P 0.001);与si-circ_0092315 组比较，si-circ_0092315+抑制物对照组TPC-1 细胞HMGA2 表达差异无统计学意义(0.224 0.023 比 0.237 0.036，t=0.967，P=0.346);与 si-circ_0092315+抑制物对照组比较，si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组 TPC-1 细胞 HMGA2 表达显著增加(0.528 0.048 比 0.224 0.023，t=17.955，P 0.001)(图 3C)。过表达 HMGA2 和 si-circ_0092315 对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响CCK-8 法检测结果显示，si-circ_ 0092315+过表达 HMGA2 组 TPC-1 细胞在 24、48、72 h 的细胞增殖能力显著高于 si-circ_0092315+空载体组(F=3980.506，P 0.001)，si-对照+空载体组、si-circ_ 0092315 组、si-circ_ 0092315+空载体组、si-circ_0092315+过表达 HMGA2 组 OD 值变化趋势差异有统计学意义(F=1016.712，P 0.001)(图4A)。Transwell 实验检测结果显示，与 si-对照+空载体组比较，si-circ_0092315 组 TPC-1 细胞侵袭能力显著下 降(35.100 2.079 比 104.800 1.932，t=77.658，P 0.001);与 si-circ_ 0092315 组比较，si-circ_0092315+空载体组 TPC-1 细胞侵袭能力差异无统计学意义(35.600 2.271 比 35.100 2.079，t=0.514，P=0.614);与 si-circ_0092315+空载体组比较，si-circ_0092315+过表达HMGA2 组TPC-1 细胞侵袭能力显著升高(82.200 4.614 比 35.600 2.271，t=28.656，P 0.001)(图 4B)。讨论近年来越来越多的研究表明 circNA 的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究结果发现 circ_0092315 在甲状腺乳头状癌细胞中呈高表达，且通过调控 mi-1256/HMGA2 通路促进 TPC-1 细胞的增殖和侵袭。circNA 通过分子海绵作用结合 miNA 从而调控蛋白表达发挥生物学作用。有文献报道 circ_0087862可以竞争性结合 mi-1253，通过调控 as 癌基因家族蛋白 ab3D 的表达促进非小细胞肺癌的进展 6;circ_0001955 吸附 mi-516a-5p 上调肿瘤坏死因子受体相关A.CCK-8 法检测 si-circ_0092315 和 mi-1256 抑制物对 TPC-1 细胞增殖能力的影响;B.Transwell 实验检测 si-circ_0092315 和 mi-1256抑制物对 TPC-1 细胞侵袭能力的影响图 2circ_0092315 和 mi-1256 抑制物对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响中 国 医 学 科 学 院 学 报20February，2023HMGA2:高迁移率族蛋白 A2A.Targetscan 数据库预测 mi-1256 与 HMGA2 的结合位点;B.Western blot 检测 mi-1256 对 TPC-1 细胞 HMGA2 表达的影响;C.Western blot 检测各组细胞 HMGA2 蛋白表达图 3circ_0092315 和 mi-1256 对 TPC-1 细胞 HMGA2 表达的影响A.CCK-8 法检测 si-circ_0092315 和 HMGA2 对 TPC-1 细胞增殖能力的影响;B.Transwell 实验检测 si-circ_0092315 和 HMGA2 对 TPC-1细胞侵袭能力的影响图 4circ_0092315 和 HMGA2 对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的影响circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭Vol.45 No.121因子 6/丝裂原激活蛋白激酶 11 的表达促进肝癌细胞的增殖和迁移 7。本研究通过生物信息方法预测 circ_0092315 靶基因，发现 circ_0092315 与 mi-1256 存在互补结合位点，干扰 circ_0092315 可上调 mi-1256 表达，抑制 TPC-1 细胞的增殖和侵袭能力。mi-1256 已被证实在多种肿瘤中起到肿瘤抑制作用，其表达下调会促进肿瘤的生长和转移。Chang 等 8 研究发现 circ_0026134 通过分子海绵机制下调 mi-1256 和 mi-1287表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭;Cai 等9 研究显示 circHECTD1 通过靶向下调 mi-1256 表达激活-连环蛋白/c-Myc 信号通路促进胃癌的进展。因此，circNAs 可能通过负调控 mi-1256 的表达发挥促癌作用。本研究通过 Targetscan 数据库分析发现 HMGA2 是mi-1256 的靶基因，且 mi-1256 抑制 HMGA2 表达。HMGA2 在多种恶性肿瘤中存在过表达现象，并通过多种机制促进肿瘤的发生 10。Dong 等 11 研究显示 HMGA2参与驱动的 FOXL2 反式激活可直接调节对化疗耐药胃癌的转移和上皮间质转换。Ma 等 12 研究表明 mi-302a-5p/367-3p 介导 HMGA2 表达可调控子宫内膜癌细胞的恶性表型。此外，近年来研究发现 circNA 可通过调控HMGA2 促进肿瘤进展，circ_100565 通过 mi-506-3p/HMGA2 促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭13;circFAM73A 调控 mi-490-3p/HMGA2 增强胃癌细胞干性 14。本研究结果显示，过表达 HMGA2 可以逆转 si-circ_0092315 对 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力的抑制作用，提示 HMGA2 参与 circ_0092315 对 TPC-1 细胞的促增殖和侵袭作用。综上，本研究结果发现，circ_0092315 在人甲状腺乳头状癌 TPC-1 细胞中呈高表达，通过内源竞争 NA机制调控 mi-1256/HMGA2 通路，促进 TPC-1 细胞的增殖和侵袭能力。但本研究缺乏体内实验的验证;此外，mi-1256/HMGA2 下游的分子机制还有待进一步研究。参考文献 1 韩婧，康骅.甲状腺癌的发病现状及影响因素 J 实用预防医学，2018，25(7):894-896.DOI:10.3969/j.issn.1006-3110.2018.07.037.2 中华人民共和国国家卫生健康委员会.甲状腺癌诊疗规范(2018 年版)J 中华普通外科学文献(电子版)，2019，13(1):1-15.DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2019.01.001.3 Chen L，Huang C，Shan G.Circular NAs in physiology andnon-immunological diseases J Trends Biochem Sci，2022，47(3):250-264.DOI:10.1016/j.tibs.2021.11.004.4 Liu F，Zhang J，Qin L，et al.Circular NA EIF6(Hsa_circ_0060060)sponges mi-144-3p to promote the cisplatin-resistance of human thyroid carcinoma cells by autophagy 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