GLUT基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响_葛欣竺.pdf

39(1)98-110 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2021-12-17 基金项目：国家重点研发计划（2017YFD0201000）；杭州市农业/社会发展主动设计项目（20190101A01）；杭州师范大学 2022 年星光计划创新项目 作者简介：葛欣竺，E-mail：；*通信作者，教授，博士，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2022.03.013 GLUT基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响 葛欣竺，李 燕，顾 珊，王莎莎，晁 蕾，蔡文杰，李航宇，方胤杰，王世贵，唐 斌*（杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 311121）摘要：异色瓢虫 Harmonia axyridis 是一种重要的捕食性瓢虫，可捕食多种蚜虫及其他害虫。目前，已被世界各地广泛用于农业害虫的生物防治。为实现短时间低成本快速扩繁异色瓢虫，人们对异色瓢虫人工饲料的配方进行了大量研究，使其更好地完成瓢虫的生长发育。实验室前期筛选出添加海藻糖和葡萄糖的人工饲料，能增加幼虫体质量、缩短瓢虫产卵前期、提升产卵量和卵孵化率等，有助于瓢虫的生长发育和繁殖。本文以饲喂蚜虫组为对照组，对 2 个葡萄糖转运蛋白基因（GLUT1 和 GLUT4）在异色瓢虫发育各阶段的表达情况进行了研究，并通过 RNA 干扰技术，进一步探究了注射 dsGLUT1 或 dsGLUT4 后异色瓢虫体内能量代谢相关基因的表达情况和酶活性变化，从而证明该基因与异色瓢虫幼虫能量代谢的调节功能密切相关。结果表明：注射 dsGLUT1 和 dsGLUT4 显著影响了 TPS、TRE2、TRE2-like 等基因的表达，同时发现在干扰 GLUT1 和GLUT4 在幼虫体内的表达后，糖原、葡萄糖、海藻糖等糖类物质含量均有所下降。表明 GLUT1 和 GLUT4在异色瓢虫幼虫的繁殖中起到一定的调控作用。研究结果有助于为未来进一步研究关键基因表达与异色瓢虫幼虫能量代谢之间的关系提供理论支持，为合理地利用异色瓢虫进行生物防治提供技术指导和参考依据。关 键 词：异色瓢虫；人工饲料；葡萄糖；葡萄糖转运蛋白；RNA 干扰；能量代谢 中图分类号：S476.2 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0098-13 Effects of GLUT Gene Expression on Energy Metabolism in Harmonia axyridis GE Xinzhu,LI Yan,GU Shan,WANG Shasha,CHAO Lei,CAI Wenjie,LI Hangyu,FANG Yinjie,WANG Shigui,TANG Bin*(College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 311121,China)Abstract:Harmonia axyridis is an important predatory ladybug that preys on a variety of aphids and other pests.At present,it has been widely used in the biological control of agricultural pests all over the world.In order to achieve rapid propagation of ladybugs at low cost in a short period of time,a lot of research has been done on the formula of artificial diet for ladybugs,so that they can complete growth and development.The artificial diet supplemented with trehalose and glucose was screened out in the laboratory,which can increase ladybug larval body weight,shorten the pre-oviposition period,and increase fecundity and the egg hatching rate,and benefit the growth,development and reproduction of the ladybugs.With ladybugs feeding aphid as the control group,the expression of two glucose transporter genes(GLUT1 and GLUT4)at various developmental stages of H.axyridis was analyzed,and the RNA interference technology was used to further explore the expression of dsGLUT1 or dsGLUT4 after injection.The expression and enzymatic activity of energy metabolism-related genes in H.axyridis proved that this gene is closely related to the regulation function of energy metabolism in H.axyridis larvae.The results showed that injection of dsGLUT1 and dsGLUT4 significantly affected the expression of TPS,TRE2,TRE2-like and other genes,and it was 第 1 期 葛欣竺等：GLUT 基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响 99 found that the contents of glycogen,glucose,trehalose and other carbohydrates decreased after interfering with the expression of GLUT1 and GLUT4 in larvae.It indicates that GLUT1 and GLUT4 play a certain regulatory role in the reproduction of H.axyridis larvae.The results of the study will help provide theoretical support for further research on the relationship between key gene expression and energy metabolism of H.axyridis larvae in the future and provide technical guidance and reference for rational use of H.axyridis in biological control.Key words:Harmonia axyridis;artificial feed;glucose;glucose transporter;RNA interference;energy metabolism 异色瓢虫 Harmonia axyridis(Pallas)属鞘翅目 Coleoptera，瓢虫科 Coccinellidae，原产于亚洲地区，是一种重要的捕食性天敌昆虫1,2。它具有非常强的适应能力3，适于多种农业生态系统，异色瓢虫是一种多效捕食者，被广泛应用于各种种植体系中，作为有效的蚜虫生物防治剂。Wang 等4和 Pan 等5在中国发现了异色瓢虫和烟蚜茧蜂 Aphidius gifuensis Ashmead，并明确了这两种昆虫捕食包括桃蚜 Myzus persicae(Sulzer)在内的多种蚜虫的生物防治功能。相关研究发现，异色瓢虫是山核桃树 Carya cathayensis Sarg.上所有高度陷阱中捕获数目最多的物种，并且以山核桃树冠中的蚜虫为食，对控制山核桃树冠中蚜虫种群数目起到潜在的制衡作用6。除此之外，异色瓢虫对亚洲柑橘木虱 Diaphorina citri(Kuwayama)也存在着相似的控制作用7。这些成功的实际应用案例充分证明了异色瓢虫在生物防治体系内不可或缺的地位1。采用人工饲料大量繁殖天敌是提高生物防治的重要手段8。然而目前，以三级食物链“蚕豆-蚜虫-异色瓢虫”进行的异色瓢虫的人工扩繁存在着空间利用需求大、饲养成本高等问题，难以实现产业化生产。如何短时间低成本快速扩繁大量特定天敌昆虫种群一直是天敌昆虫产业化生产需要解决的问题。以人工饲料代替天然食料方案的提出为实现天敌昆虫的饲养和种群扩繁提供了解决方案，因而筛选和改进人工饲料配方对于提高瓢虫繁殖力、促进产业化生产至关重要。昆虫正常的生长发育离不开适宜的营养物质的平衡，人工饲料中不仅要包含昆虫生长发育所需的所有营养成分，还要满足昆虫营养在量方面的需求。营养物质的平衡比率是任何食物产生营养价值的主导因素，人工饲料中碳水化合物和蛋白质的比例，对昆虫的生长发育有很大的影响，并且不同的生长期，要求的比例也不同。自 20 世纪 50 年代以来，人们对不同种类蚊子的人工饲料配方进行了大量研究，旨在开发蚊子的人工饲料，以解决脊椎动物血液成本高且难以长期储存的问题，进而实现蚊子的大规模生产，为以蚊子为媒介的疾病研究提供实验材料9-12。Pinto 等13在 Nalin 改良的人工饲料的基础上，分别用玉米粉代替小麦胚芽的人工饲料以及用新鲜玉米代替豆类的人工饲料饲喂草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda，并以雄性和雌性蛹的重量、性别比例、繁殖力等为营养指标，对 3 种饮食进行评估，进而得出结论：卵孵化期以豆类为主的基础饲料和以新鲜玉米代替豆类的饲料喂养下的草地贪夜蛾发育完整，成活率更高，繁殖力更强。在对凤仙花天蛾 Theretra oldenlandiae(Fabricius)的人工饲料配方的研究中，人们以添加乌蔹莓 Cayratia japonica(Thunb.)Gagnep.干粉的人工饲料为基础饲料，对几种添加有不同比例的商品饲粮、LFM 昆虫饲粮（昆虫幼虫人工饲料，Insect Larva Food）和干叶粉饲粮，并添加不同的抗生素的人工饲粮进行试验，确定了凤仙花天蛾幼虫表现最佳的饲粮组成14。而迄今为止，国内外就异色瓢虫人工饲料配方的开发也进行了大量研究15-18。尽管这些人工饲料都能完成瓢虫的生长发育，但是其对体质量、化蛹率和羽化率的影响较大，特别是生殖力低下成为制约瓢虫人工饲料发展的瓶颈19,20，而影响成虫的生殖能力很有可能源于体内氨基酸和脂肪酸的含量降低21,22。生殖是昆虫重要的生命过程，食物质量是影响昆虫发育和繁殖的关键因素，且这一点在异色瓢虫中尤其明显。前人早在 2003 年就发现培养基中加入葡萄糖和 20-羟基蜕皮激素能够促进家蚕体外精母细胞的繁殖力增加23，葡萄糖的饲喂能够明显促进昆虫交配行为的发生24，受精卵细胞的成熟同样需要更多葡萄糖25，并且葡萄糖、海藻糖和果糖都能增加卵细胞的成熟与数量26。此外，通过对两种寄生蜂寿命和繁殖力的研究发现：12 种天然糖中，仅葡萄糖能够延长其寿命和繁殖能力27；当然，寄主中适量的葡萄糖能够促进褐飞虱短翅型（繁殖型）发育，而过量的葡萄糖则促进长翅型（迁飞型）转变28，表明葡萄糖可能阻碍胰岛素通路而导致繁殖力下降。因此，适量的葡萄糖能够显著地提高昆虫的繁殖力。葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，GLUT）是细胞葡萄糖代谢和糖酵解的第一限速酶29。包括昆虫在内的动物，都需要 GLUT 进行细胞内外物质输送，进而葡萄糖代谢为动物生长、发育、繁殖提供能量30,31。100 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 在哺乳动物体内，葡萄糖转运蛋白 1（GLUT1，由 Slc2al 基因编码）被认为是人体血脑屏障的内皮细胞内运输碳水化合物的主要承担者32。有研究表明，胰岛素诱导的低血糖导致大鼠血脑屏障内皮细胞中 GLUT1 mRNA 的转录和 GLUT1 蛋白水平的上调33。而昆虫的神经系统是被类似血液的血淋巴包围的。据报道，果蝇中碳水化合物转运蛋白的表达与哺乳动物中类似，可以随循环中碳水化合物摄取含量的变化而变化32。有研究表明增强果蝇葡萄糖转运蛋白在神经细胞中的表达，可以加快葡萄糖转运体协助葡萄糖的跨膜转运过程，以维持神经元活动34。在斯氏按蚊 Subgenus stephensi Liston 的研究中提出不同的 GLUT 基因具有不同的表达模式，表明它们在葡萄糖运输中可能发挥不同的作用。进一步研究发现抑制斯氏按蚊体内 GLUT1的表达后，斯氏按蚊中肠中的葡萄糖水平提高，表明 GLUT1 在维持肠道葡萄糖稳态方面具有重要作用35。有报道表明葡萄糖的代谢及其调节对白蚁 Termitidae 繁殖力有重要的调控作用，且食物来源的葡萄糖对雌性成虫尤为重要，为成虫的繁殖提供能量，促使卵子成熟36。海藻糖不仅参与昆虫的能量贮存、各项生理活动的氧化供能，还能通过葡萄糖代谢，促进碳水化合物等多糖物质转变脂类、氨基酸等，并为昆虫的生长发育和繁殖提供能量来源37。葡萄糖是昆虫体内营养和能量的供给，直接影响着昆虫发育和繁殖等生理活动。前期研究发现添加葡萄糖的人工饲料对异色瓢虫的繁殖能力有促进或增效作用38；且已有相关研究表明 GLUT1 介导的葡萄糖通过糖酵解影响葡萄糖代谢39；GLUT4 响应并参与饲喂食物后胰岛素调控的糖代谢途径34，GLUT4 表达被抑制后直接导致昆虫葡萄糖运输损失及代谢降低40。那么 GLUT 是如何调控昆虫海藻糖代谢进而影响繁殖？其体内的糖类物质如何被相关基因调控？这些有关异色瓢虫在GLUT调节下的能量代谢机制方面的研究鲜见报道。因此，探究 GLUT 对异色瓢虫幼虫能量代谢的调控机制非常必要，可以通过改进异色瓢虫的人工饲料配方，实现异色瓢虫的扩繁，为天敌昆虫应用于生物防治提供技术支持。已有研究证实，在常规人工饲料中添加海藻糖和葡萄糖，会使异色瓢虫幼虫重量增加、产卵前期缩短、产卵量和卵孵化率显著提升。因此，海藻糖和葡萄糖可作为异色瓢虫生长、发育和繁殖的潜在增效物质38,41。本文在以猪肝为主的常规人工饲料配方中添加不同比例的潜在增效物质，以蚜虫饲喂和常规人工饲料配方饲喂作为对照组。通过探讨 RNA 干扰前后 GLUT1 和 GLUT4 在异色瓢虫发育各阶段的表达情况以及增效人工饲料对某些营养成分、相关基因的分析进而评估糖类饮食对异色瓢虫生长繁殖的影响。评估通过添加增效物质，寻找筛选更加有效优质的天敌昆虫人工饲料配方的可能性，为设计有效的人工饲料配方提供有力依据。1 材料与方法 1.1 供试昆虫 本试验所用昆虫为实验室长期饲养异色瓢虫种群，期间有从校园及周边田间采集野外种群复壮。饲养方式为种植蚕豆供蚜虫取食，然后将异色瓢虫转到接有足量蚕豆蚜 Acyrthosiphon pisum 的蚕豆苗上进行扩繁。人工气候室饲养条件设置为温度（251），相对湿度（705）%，光周期 14L:10D。1.2 人工饲料的配制 本试验以饲喂蚜虫为对照组（CK）。设置 3 种人工饲料，分别为基础人工饲料（Diet 1）、添加 12%葡萄糖的人工饲料（Diet 2）、添加 20%海藻糖的人工饲料（Diet 3）。研究前期发现，在人工饲料中添加12%的葡萄糖和 20%的海藻糖能缩短异色瓢虫的产卵前期，提升产卵量和卵孵化率等相关生殖力指标，有助于异色瓢虫的生长发育和繁殖41。基础人工饲料制备：将鲜猪肝洗净捣碎成糊状；维生素 C 片研磨成粉状；然后将称取好的 10 g 蜂蜜、20 g 蔗糖、0.5 g 维生素 C 粉末和 5 g 蜂王浆放入容器中搅拌混匀；把处理好的 100 g 鲜猪肝混入容器中，充分搅拌均匀，得到半流体态的基础人工饲料。Diet 2 的制备是在基础饲料的基础上，再添加 0.12 g 葡萄糖后充分搅拌。Diet 3 的制备是在基础饲料的基础上，再添加 0.2 g 海藻糖后充分搅拌。将所制备得到的 3 种人工饲料放-20 冰箱中保存。1.3 总 RNA 的抽提与反转录 使用 Trizol 法抽提异色瓢虫总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和 NanoDropTM 2000 微量核酸测定仪检测RNA 的质量和浓度。然后根据 Takara PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书进行反转录试验，获得 cDNA 的第一条链。第 1 期 葛欣竺等：GLUT 基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响 101 1.4 双链 RNA 的合成 使用软件 Primer 5 设计异色瓢虫 GLUT1 和 GLUT4 基因的双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）合成的特异性引物进行 PCR 扩增，具体引物序列见表 1。然后对产物进行 T 克隆和交叉 PCR 反应，随后采用 T7 RiboMAXTM Express RNAi System 试剂盒合成出 dsGLUT1 和 dsGLUT4。本试验以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因作为对照组，所以采用同样的方法合成出 dsGFP。表 1 合成 dsGLUT 和 dsGFP 所需引物序列 Table 1 Primers required for synthesis of dsGLUT and dsGFP 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(5-3)dsHaGLUT1-F GCGGTATCAACGCTGTATT dsHaGLUT1-R GATGAAGAAGTTCCCTCCC dsHaGLUT1-FT T7-GCGGTATCAACGCTGTATT dsHaGLUT1-RT T7-GATGAAGAAGTTCCCTCCC dsHaGLUT4-F GTTCGCTCCTAAAGACTCCATC dsHaGLUT4-R TTCTTTGGCTTCTTTTCGTATC dsHaGLUT4-FT T7-GTTCGCTCCTAAAGACTCCATC dsHaGLUT4-RT T7-TTCTTTGGCTTCTTTTCGTATC dsGFP-F AAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG dsGFP-R CAGCAGGACCATGTGATCGCGC dsGFP-FT T7-AAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG dsGFP-FT T7-CAGCAGGACCATGTGATCGCGC T7 GGATCCTAATACGACTCACTATAGG 1.5 显微注射 首先通过调节显微注射系统的气压和时间，使得标准毛细管每次泵出所需注射体积。同时将异色瓢虫4 龄幼虫置于冰上，待幼虫昏迷后，将 dsRNA 注射进幼虫体内。每头注射量为 200 ng，注射部分为幼虫腹部较软部位。随后对成功注射的幼虫分别饲喂蚜虫和 3 种人工饲料用于后续试验收集试验材料。1.6 实时荧光定量 PCR 使用 Primer 5 软件设计出基因 GLUT1 和 GLUT4 的实时荧光定量 PCR 的特异性引物，具体引物序列见表 2。收集显微注射 dsRNA 后 48 h 的幼虫材料用于检测靶标基因 GLUT1 和 GLUT4，及其他关键基因的表达水平。反应体系为（20 L）：10 L SYBR Premix Ex Taq；1 L 正向/反向引物；1 L 模板 cDNA；7 L灭菌水。反应程序：95 预变性 2 s，95 解链 30 s，59 退火并延伸 30 s，35 个循环。最后用 2CT方法42计算出基因的相对拷贝数。表 2 实时荧光定量 PCR 所需引物序列 Table 2 Primers required for real-time quantitative PCR 基因名称 Gene name 正向引物 Forward primer(5-3)反向引物 Reverse primer(5-3)GLUT1 CTTACTTGAGTATTGTGGGT CTCCAAGATGCCTGTTC GLUT4 AGCTGAAGATGAAAGTGAAGGA AGGAGCGAACACACCTTGTA GS CCCTTAGGATCGGATGTTCTC CACCAGCCATCTCCCAGTT GP GCTGAAGCCCTCTACCAACT CGCCGTACTCGTATCTTATGC TRE1-1 GATGCAATCAAGGAGGTGTTATGGC CGTATTCACCTCCACCTCCGT TRE1-2 AGATGAAGGCATGTGGTTCG CATCGATTCGCCAACTGGTAAGC TRE2-like TATCAACCCTCCCTTCTT TAGCCATATCGTTCCACTA TRE2 CCCAAGGACTGGATAAG CAATAAAGGTGGTTGAGAA TPS GACCCTGACGAAGCCATACC AAAGTTCCATTACACGCACCA rp49 GCGATCGCTATGGAAAACTC TACGATTTTGCATCAACAGT 102 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 1.7 糖含量和海藻糖酶活性的检测 取 3 只幼虫作为一个试验重复，每个处理进行 3 次生物学重复。试验材料进行破碎前处理，然后通过1000 g 和 20800 g 超离心获得 3 部分试验材料。1000 g 离心后的上清液用于测定蛋白质、总糖原和海藻糖含量；20800 g 离心后的上清液用于测定葡萄糖、蛋白质含量以及可溶性海藻糖酶活性；向 20800 g 离心后的沉淀中加入 300 L 的 PBS，并混匀获得沉淀悬浮液用于测定葡萄糖、蛋白质含量和膜结合型海藻糖酶活性42。1.8 数据统计与分析 使用 Microsoft Office Excel 2010 软件整理和分析试验数据。采用软件 IBM SPSS Statistics 20 中单因素方差分析中的 Tukey 法分析不同处理中异色瓢虫幼虫体内关键基因的表达、组织血淋巴糖含量、海藻糖酶活性的差异显著性，不同字母之间表示具有显著性差异。最后，运用软件 GraphPad Prism version 8.4.0 绘制结果图，作图数据为平均值标准误。2 结果与分析 2.1 不同发育历期 GLUT1 和 GLUT4 的表达水平 GLUT1 和 GLUT4 在蛹期和成虫期的变化趋势一致，均在蛹初期表现出高水平随后降低，接着又逐渐升高（图 1）。在幼虫期，GLUT1 在 3 龄末期（1.230.33）和 4 龄初期（1.780.48）表达水平高于 3 龄初期（0.840.17）和 4 龄末期（0.800.04）（图 1A）。而幼虫期间 GLUT4 的表达水平在 3 龄初期（1.000.03）和 4 龄初期（0.820.30）较高，3 龄末期（0.530.03）和 4 龄末期（0.580.10）表达水平较低（图 1B）。由结果可以看出，GLUT1 的相对表达量在蛹初期和成虫阶段较高，GLTU4 的相对表达量在 4龄初期、蛹初期和成虫阶段较高。根据这一检测结果，在试验取材上我们选取了 4 龄的幼虫作为主要研究对象。3E3L4E4LPEPLNEC01234GLUT1aabbcbcbcbccc3E3L4E4LPEPLNEC01234发育历期 Developmental durationGLUT4abbccdcddddBA发育历期 Developmental duration 3E：3 龄初期 Early 3rd larvae；3L：3 龄末期 Late 3rd larvae；4E：4 龄初期 Early 4th larvae；4L：4 龄末期 Late 4th larvae；PE：蛹初期 Early pupae；PL：蛹末期 Late pupae；NE：羽化期 New eclosion；C：繁殖期 Copulation 注：不同字母表示不同组别之间存在显著性差异，P0.05；下同。Note:Tukeys test,different letters indicate significant differences between different groups,P0.05;the same below.图 1 异色瓢虫各阶段 GLUTs 的表达水平 Fig.1 Expression levels of GLUTs in Harmonia axyridis at different stages 2.2 人工饲料饲喂下关键基因的表达水平 整体上看，与饲喂蚜虫的瓢虫相比较，饲喂 3 种人工饲料的瓢虫体内 GLUT1 和 GLUT4 的表达水平在 12 h、24 h 和 48 h 几乎都表现为不同程度的下调（图 2A、B）。进一步分析，可知 GLUT1 的表达量在人工饲料组间没有显著差异（图 2A）；GLUT4 在 48 h 时也在 3 组间表达水平接近，而在 12 h 时添加葡萄糖的人工饲料组 GLUT4 的表达水平显著高于其余两种人工饲料组，饲喂添加有葡萄糖或海藻糖的人工饲料组在 24 h 时 GLUT4 的表达水平高于基础人工饲料组（图 2B）。与饲喂蚜虫的瓢虫相比较，饲喂 3 种人工饲料的瓢虫体内除 GLUT1 和 GLUT4 外的关键基因（TPS、TRE2、TRE2-like 等）的表达水平第 1 期 葛欣竺等：GLUT 基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响 103 均表现为下调。进一步比较分析，可以发现这些关键基因在瓢虫体内的表达水平在 12 h、24 h、48 h 几乎都呈现出相似的结果：饲喂添加有葡萄糖或海藻糖的人工饲料的瓢虫关键基因的表达水平高于基础人工饲料组。饲喂时长 Feeding duration00.51.01.5acbcaacdbccbG GS12 h24 h48 h相对表达水平Relative expression level饲喂时长 Feeding duration00.51.01.5aabbbaaabbbbbbAGLUT100.51.01.5CKDiet 1Diet 2Diet 3acbcacbcbabbbBGLUT412 h24 h48 h00.51.01.5adbcaabdcccbCTPS00.51.01.5acbcaabcbbbbDTRE212 h24 h48 h00.51.01.5acbbaabdbccbbETRE2-like12 h24 h48 h00.51.01.5acbcaabcbbbbFGP相对表达水平Relative expression level12 h24 h48 h12 h24 h48 h12 h24 h48 h相对表达水平Relative expression level相对表达水平Relative expression level相对表达水平Relative expression level相对表达水平Relative expression level相对表达水平Relative expression level饲喂时长 Feeding duration 注：TPS（trehalose-6-phosphate synthase）是海藻糖合成酶基因，TRE2 是膜结合型海藻糖酶基因，TRE2-like 是类似膜结合型海藻糖酶基因，GP（glycogen phosphorylase）是糖原磷酸化酶基因，GS（glycogen synthase）是糖原合成酶基因。Note:TPS(trehalose-6-phosphate synthase)is a trehalose synthase gene,TRE2 is a membrane-bound trehalase gene,TRE2-like is a similar membrane-bound trehalase gene,GP(glycogen phosphorylase)is a glycogen phosphate glycogenase gene,GS(glycogen synthase)is a glycogen synthase gene.图 2 不同组别异色瓢虫基因的表达情况 Fig.2 Gene expression of different groups of Harmonia axyridis 2.3 人工饲料饲喂下对 GLUT1 和 GLUT4 的抑制效果 图中 GLUT1 的表达水平在注射 dsGLUT1 后，饲喂蚜虫和基础人工饲料组表现为下调；而饲喂添加有葡萄糖或海藻糖的人工饲料组急剧下调（图 3A）。类似地，在幼虫的处理结果中 GLUT4 被抑制后对基因的表达有极显著影响，表达水平在 4 组中急剧下降，相对表达水平极低，而 4 组间的表现无显著差异（图 3B）。104 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 dsGFP-CK00.51.01.5处理组别 Treatment groupsGLUT1bAabccc-0.500.51.01.5bBabbb相对表达水平 Relative expression leveldsGLUT1-CKdsGLUT1-Diet1dsGLUT1-Diet2dsGLUT1-Diet3dsGFP-CKdsGLUT1-CKdsGLUT1-Diet1dsGLUT1-Diet2dsGLUT1-Diet3相对表达水平 Relative expression levelGLUT4处理组别 Treatment groups 图 3 不同组别异色瓢虫 RNAi 后 GLUTs 的表达水平 Fig.3 Expression levels of GLUTs in different groups of Harmonia axyridis after RNAi 2.4 RNAi 后对异色瓢虫幼虫糖类物质含量的影响 注射 dsGLUT1 后，与注射 dsGFP 组相比较，饲喂蚜虫组异色瓢虫幼虫组织和血淋巴内的 3 种糖类化合物的含量水平几乎都表现为下调。进一步分析，注射 dsGLUT1 后，与饲喂蚜虫组相比，添加有葡萄糖和海藻糖组的异色瓢虫组织中糖原含量表现为下调。Diet 1 和 Diet 3 组的瓢虫血淋巴内的糖原含量表现为下调，Diet 2 喂养下的异色瓢虫血淋巴体内的糖原含量表现为急剧下调（图 4A）。饲喂 Diet 2 和 Diet 3 的瓢虫组织内的海藻糖含量较饲喂蚜虫组表现为上调，而饲喂 Diet 1 组海藻糖的含量表现为下调。人工饲料喂养下的瓢虫血淋巴内的海藻糖含量较饲喂蚜虫组均表现为下调，且 3 组间含量水平接近（图 4B）。与饲喂蚜虫组异色瓢虫组织内的葡萄糖含量相比，饲喂普通人工饲料组表现为下调。Diet 1 组和 Diet 3 组瓢虫血淋巴内葡萄糖含量较饲喂蚜虫组表现为上升（图 4C）。同样地，在 GLUT4 干扰后，与注射 dsGFP 组相比较，饲喂处理的幼虫血淋巴和组织中的糖原含量均表现为显著下降。其中在干扰并饲喂 Diet 1 的处理组为显著下降（图 4D），在海藻糖含量的结果中可以看出干扰并饲喂 Diet 1 处理组幼虫组织中表现为显著下降，血淋巴中为显著下降（图 4E）。干扰并饲喂 Diet 2 和 Diet 3 的处理组血淋巴中的海藻糖无显著变化；在葡萄糖含量的检测结果中发现注射 dsGLUT4 并饲喂 Diet 1 后组织中的葡萄糖含量相较于注射 dsGFP组无显著变化，而幼虫血淋巴中的葡萄糖含量表现为显著下降（图 4F）。2.5 RNAi 对瓢虫幼虫体内海藻糖酶活性的影响 RNAi 后与注射 dsGFP 组相比较，饲喂蚜虫组异色瓢虫幼虫组织和血淋巴内的海藻糖酶活性相差不大。相较于饲喂蚜虫组，饲喂添加有葡萄糖的人工饲料组瓢虫组织和血淋巴内的可溶性海藻糖酶活性表现为下降。饲喂普通人工饲料幼虫组织和血淋巴内的可溶性海藻糖酶活性表现为急剧下降。饲喂添加葡萄糖的人工饲料幼虫组织内和饲喂普通人工饲料血淋巴内膜结合型海藻糖酶活性均表现为下降。而饲喂普通人工饲料和添加海藻糖的人工饲料幼虫组织内的膜结合型海藻糖酶活性则急剧下降（图 5）。相较于注射 dsGFP组，注射 dsGLUT1 后，饲喂蚜虫组中瓢虫幼虫组织和血淋巴内的可溶性海藻糖酶活性均表现为下降（图5A），而膜结合型海藻糖酶活性则与之水平相当（图 5B）。相较于饲喂蚜虫组，注射 dsGLUT4 后，饲喂添加有葡萄糖或海藻糖的人工饲料瓢虫幼虫组织内和血淋巴内可溶性海藻糖酶活性（图 5C）和饲喂普通人工饲料组可溶性海藻糖酶活性（图 5D）均表现为上升。而饲喂普通人工饲料组瓢虫幼虫体内膜结合型海藻糖酶活性相较于饲喂蚜虫组表现为下调。3 讨论 异色瓢虫作为一种天敌昆虫，是农业生态系统中的重要生物因子44。然而，天然食物具有季节性短缺的特点，因此人工饲料的研发成为突破季节性限制、满足相关试验需要的关键。而如今大量研究旨在通过对人工饲料配方的改进，使之在完成瓢虫的生长发育的基础上，最大程度减小其对体质量、生殖力、化蛹 第 1 期 葛欣竺等：GLUT 基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响 105 00.20.40.60.8abbbccaacbcbcA组织 Tissue00.20.40.60.8cbbcaacbcbcDb00.20.40.60.8abcaaaabbbbB00.20.40.60.8abcaaabbaaE00.51.01.52.0abcbabbaaCb00.51.01.5abacabcbcbFbc血淋巴 HemolymphdsGFP-CKdsGLUT1-CKdsGLUT1-Diet1dsGLUT1-Diet2dsGLUT1-Diet3组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph 图 4 RNAi 后异色瓢虫幼虫组织和血淋巴糖含量 Fig.4 The content of sugars in the tissues and hemolymph of the Harmonia axyridis larvae after RNAi 00.020.040.060.080.10acbabaaccbaA00.020.040.060.080.10acabbaacabaB00.050.100.150.20babaaaabaaC00.020.040.060.080.10acbcbaabcabaDdsGFP-CKdsGLUT1-CKdsGLUT1-Diet1dsGLUT1-Diet2dsGLUT1-Diet3组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph组织 Tissue血淋巴 Hemolymph膜结合型海藻糖酶活性Menbrane-bound trehalase activity(nmol glucose/g protein/minute)可溶性海藻糖酶活性Soluble trehalase activity(nmol glucose/g protein/minute)膜结合