基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究.pdf
《基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究.pdf(13页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、第 41 卷 第 6 期2023 年 11 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.6Nov.2023doi:10.12301/spxb202300071文章编号:2095鄄6002(2023)06鄄0075鄄13引用格式:张皓月,侯娇,杨相政,等.基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究J.食品科学技术学报,2023,41(6):75-87.ZHANG Haoyue,HOU Jiao,YANG Xiangzheng,et al.Study on citric acid degradation p
2、athways of blood orange during seg鄄ment drying based on widely targeted metabolomicsJ.Journal of Food Science and Technology,2023,41(6):75-87.基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究张皓月1,摇 侯摇 娇1,摇 杨相政2,摇 李摇 健3,摇 曾凯芳1,摇 姚世响1,*(1.西南大学 食品科学学院/国家柑桔工程技术研究中心/川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆摇 400715;2.中华全国供销合作总社 济南果品研究所,山东 济南摇 250204
3、;3.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京摇 100048)摘摇 要:枯水是影响柑橘果实品质的主要生理性病害,果实发病后风味寡淡,不堪食用。枯水主要类型为汁胞粒化型枯水和汁胞萎缩型枯水,后者研究较少。以汁胞萎缩型枯水的塔罗科血橙为实验材料,运用广泛靶向代谢组学分析汁胞萎缩型枯水的初生代谢物及代谢途径变化,并进一步结合氨基酸含量、关键酶活性及基因表达分析解析枯水时柠檬酸降解机制。研究结果表明:有 193 种初生代谢物的含量在汁胞枯水时显著变化,其中柠檬酸含量显著下降了 53郾 1%,乙酰辅酶 A 途径代谢产物丝氨酸、亚油酸及其他脂类物质的含量显著升高;脂代谢基因在枯水时上调表达;
4、编码 ATP鄄柠檬酸裂解酶的基因 CsACLs 的表达没有变化;谷氨酰胺合成酶活性在枯水时增加了 75郾 3%;酌鄄氨基丁酸含量没有变化,谷氨酰胺脱羧酶活性没有变化,编码谷氨酰胺脱羧酶的基因 CsGADs 在枯水时下调表达。研究表明,乙酰辅酶 A 合成途径是血橙汁胞萎缩型枯水时柠檬酸快速降解的主要机制,结果旨在为明确柑橘枯水机制提供一定的参考。关键词:塔罗科血橙;枯水;柠檬酸降解;乙酰辅酶 A 合成途径;GABA 支路中图分类号:TS255郾 3摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20230203基金项目:国家自然科学基金面上项目(31972131);国家自然科学基金青年基金项目(31
5、601520)。Foundation:National Natural Science Foundation of China(31972131);National Natural Science Foundation Youth Fund Project(31601520).第一作者:张皓月,硕士研究生,研究方向为果蔬贮藏与保鲜。摇*通信作者:姚世响,副教授,博士,主要从事果蔬贮藏与保鲜领域的研究。摇 摇 枯水是柑橘果实常见的生理性病害,主要发生于采前成熟阶段或采后贮藏阶段1。大部分柑橘栽培品种均有枯水发生的报道,如三红蜜柚和琯溪蜜柚等柚类2-3、丰脐和伦晚脐橙等甜橙类4-5、椪柑和沙糖桔等
6、宽皮柑橘类6-7、尤力克(Eureka)和里斯本(Lisbon)等柠檬类8、黄果柑和大雅柑等杂柑类9-10,以及胡柚和葡萄柚等1,11。柑橘枯水后,果实糖酸风味寡淡,严重时丧失食用品质和商品价值。柑橘果实枯水时,汁胞呈高度异质化状态,粒化和萎缩是主要的2 种类型1。汁胞枯水类型与柑橘品种有一定关系,比如柚类通常以粒化为主,宽皮柑橘和甜橙则粒化和萎缩均比较常见1。粒化汁胞呈膨大硬化表型,萎缩汁胞呈萎缩塌陷表型,2 种汁胞具有相似的糖酸风味寡淡表型。相关学者在揭示汁胞枯水时糖酸快速消耗机制方面做了大量工作。张百超等12提出“果皮过度衰57老诱导枯水冶假说,果皮过度衰老导致汁胞糖酸急剧消耗和枯水。陈
7、昆松等13提出“果皮相对再生长诱导枯水冶假说,果皮相对再生长诱发汁胞糖酸耗竭和枯水。这 2 种假说均有一定的生理数据支撑,同时这 2 种假说相互存在矛盾,这反映了柑橘枯水这 一 生 理 性 病 害 高 度 复 杂 的 特 点。Huang等1,4,6,14-15基于汁胞的大量生理证据提出“细胞壁代谢紊乱诱导枯水冶假说,果胶代谢紊乱和细胞壁物质大量合成诱导汁胞糖酸物质耗竭和枯水,该假说为柑橘枯水的分子机制研究提供了概念性基础1,11,16。此外,汁胞枯水时有机酸(主要组分为柠檬酸)的急剧消耗更为显著,其降解途径也开始被阐明3。其中,柑橘果实成熟时柠檬酸降解有 2 条主要途径 乙酰辅酶 A 合成途径
8、和 GABA 支路,第1 条途径在枯水时被显著激活3。目前枯水进程中糖酸消耗机制的研究主要是在粒化型汁胞中进行的,对萎缩型汁胞关注较少。塔罗科血橙(Citrus sinensis cv.Tarocco)在我国主要栽培于三峡库区(万州等地),是晚熟柑橘的重要品种,在 1 月底至 2 月中旬成熟,通过留树保鲜技术延长至 3 5 月上市,在冬季极端低温的年份易发生采前枯水17。本团队前期研究发现,塔罗科血橙枯水时汁胞呈萎缩状态,是典型的萎缩型枯水。近期研究揭示血橙汁胞萎缩型枯水进程中,果胶代谢紊乱和木质素合成途径激活是柑橘枯水的主要诱因,为本研究分析汁胞柠檬酸消耗机制奠定了基础14-15。本研究以塔
9、罗科血橙为实验材料,采用广泛靶向代谢组学技术系统分析汁胞枯水时初生代谢物质的变化,进一步综合运用生理、生物信息学和基因分析技术对枯水时柠檬酸消耗的机制进行解析。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂塔罗科血橙(C.sinensis cv.Tarocco)果实采于2021 年 4 月中旬重庆三峡库区的柑橘果园,当天运回位于重庆市西南大学的实验室,选择成熟度和大小一致的果实(约 200 个)用于实验,正常汁胞和枯水汁胞分别取自正常和枯水血橙果实,用液氮速冻后,-80益储存备用。次氯酸钠,分析纯,成都市科隆化学品有限公司;甲醇、乙腈,色谱纯,美国 Merck 公司;磺基水杨酸,分析纯,北京索莱宝生物
10、科技公司;PBS 溶液(磷酸盐缓冲液),分析纯,重庆跃翔化工有限公司。BC0915 谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase,GLN)活性检测试剂盒,北京索莱宝生物科技公司;BS-E18788O2 植物谷氨酰胺脱羧酶(glutamine de鄄carboxylase,GAD)ELISA 试剂盒,江苏博深生物科技有限公司。1郾 2摇 仪器与设备Scientz-100F 型冻干机,宁波新芝生物科技股份有限公司;MM400 型研磨仪,德国 Retsch 公司;TGL-18MS 型冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Nexera X2 型系列超高效液相色谱仪,日本岛津公司;SB-C
11、18 液相色谱柱,美国 Agilent 公司;4500 QTRAP 型串联质谱仪,美国 Applied Biosys鄄tems 公司;L-8900 型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;SYNERGY H1 型多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 代谢组学样本制备及超高效液相色谱串联质谱分析参考 Zhu 等18的方法进行代谢组学样品制备及超 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱(ultra performanceliquidchromatography鄄tandemmassspectrometry,UPLC鄄MS/MS)分析。将汁胞样本用冻干机冷冻干燥,使用
12、研磨仪充分研磨(30 Hz,1郾 5 min)成粉末;称取100 mg 粉末,溶解于体积分数70%甲醇提取液中,振荡 30 s,每30 min 振荡1 次,共振荡6 次,样品置于4 益过夜提取。12 000 r/min 离心10 min 后,用直径 0郾 22 滋m 的微孔滤膜过滤上清液,然后存于进样瓶中。正常汁胞样本记为 N 组,枯水汁胞样本记为 VC 组,质控样本记为 mix 组,3 组样本均设置3 个生物学重复,用于 UPLC鄄MS/MS 分析。液相 条 件:样 品 进 样 量 为 4 滋L,流 速 为0郾 35 mL/min,每个样品分析时间约为 15 min。液相色谱柱2郾 1 mm
13、 伊100 mm 伊1郾 8 滋m,柱温40 益;流动相 A 相为水(含体积分数 0郾 1%甲酸),B 相为乙腈(含体积分数 0郾 1%甲酸);洗脱梯度为 0 min 时 B相体积比例为5%,在9 min 内 B 相体积比例线性增加至 95%,并在 95%维持 1 min,然后在 1郾 1 min 内B 相比例降至 5%,并在 5%维持 3 min。质谱条件:电喷雾离子源温度为 550 益;离子喷雾电压分别为 5 500 V(正离子模式)和 4 500 V(负离子模式);离子源气体玉压力为 344郾 75 kPa、离子67食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
14、摇 摇摇 2023 年 11 月源气体域压力为 413郾 69 kPa、气帘气(curtain gas)压力为 172郾 37 kPa;碰撞诱导电离参数设置为高;三重四极杆(triple quadrupole)扫描使用多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式。1郾 3郾 2摇 代谢物质定性与定量分析将二级质谱信息与 MWDB 数据库信息比对鉴定代谢物质;用 MRM 模式进行代谢物质定量分析。使用软件 Analyst 1郾 6郾 3 处理获得的样本质谱分析数据,对物质质谱峰进行峰面积积分,并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱峰进行积分校正。代谢组数据使
15、用 MetaX 进行正交偏最小二乘判别分析(partial least squares鄄discriminant analysis),VIP(var鄄iable important in projection)逸1、fold change 逸2(或臆0郾 5)和 P 0郾 05 作为代谢物质含量具有显著性差异的判断标准。1郾 3郾 3摇 氨基酸定量分析氨基酸定量分析参考 Wang 等3的方法并略有修改。称取 0郾 5 g 汁胞粉末,加入 1郾 5 mL 体积分数为 6%磺基水杨酸,40 kHz 超声提取 30 min;4 益,12 000 r/min 离心 15 min,收集上清液后用微孔滤膜
16、(孔径 0郾 22 滋m)过滤,用全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量(ng g-1),设置 4 个生物学重复。1郾 3郾 4摇 柠檬酸降解相关酶活性测定GLN 和 GAD 活性分别用相应活性检测试剂盒测定。粗酶液分别在 540 nm 和 450 nm 处测定吸光度,酶活表示为 U/mg,GLN 活性设置 3 个生物学重复,GAD 活性设置 4 个生物学重复。1郾 3郾 5摇 脂代谢相关基因的生物信息学分析基因的生物信息学鉴定参考 Wang 等3的方法。从 TAIR11 数据库(Arabidopsis Information Re鄄source)下载拟南芥脂代谢基因家族序列,用本地Blast 软件
17、比对甜橙基因组(C郾 sinensis V1)数据库,得到的基因序列用 Pfam 分析验证蛋白质是否存在保守结构域,最终鉴定甜橙的相关基因家族成员。将甜橙脂代谢基因家族序列用 TBtools 软件分析其基因家族成员的染色体定位,并根据定位及拟南芥同源基因名称命名基因。用 Expasy 工具分析基因编码蛋白的长度、分子质量和等电点等理化特性。用基因结构显示工具(gene structure displayserver,GSDS)分析基因的外显子和内含子结构信息,用 Pfam 软件鉴定及显示蛋白质结构域。1郾 3郾 6摇 基因转录水平分析基因表达分析参考 Wang 等3的方法。提取血橙汁胞总 RN
18、A 后构建 cDNA 文库,用 Illumina Hiseq平台测序。用 TopHat v2郾 0郾 12 软件将测序数据比对甜橙基因组(C郾 sinensis),用 FPKM(fragments perkilobase per million mapped reads)表示基因表达水平。差异基因用 DESeq2 R package 软件分析(P 0郾 05),设置 4 个生物学重复。1郾 4摇 数据处理除代谢物质和基因表达数据,其他实验数据均用 Graphpad Prism 9郾 0(美国 GraphPad Software 公司)进行统计分析,用 t 检验(P 0郾 05)判别显著性差异。
19、用 Adobe Illustrator 2021 软件(美国 Adobe 公司)绘图。2摇 结果与分析2郾 1摇 气温与血橙枯水相关性的观察柑橘采前成熟阶段的气温是影响果实品质的重要因素。以三峡库区主要城市万州为例,三峡库区血橙采前阶段的气温变化和果实枯水表型见图 1。低温天气在 12 月至次年 2 月出现,部分年份甚至会低于 0 益图 1(a)。在 2020 年冬季,万州血橙果园出现一段时间-8 0 益的寒潮,次年果实出现大面积枯水现象。本研究对枯水果实进行深入观察后发现,枯水汁胞呈萎缩塌陷表型,为典型的汁胞萎缩型枯水图 1(b)。2郾2摇 血橙枯水时汁胞的广泛靶向代谢组学分析结果2郾 2郾
20、 1摇 样本主成分分析及代谢物质鉴定结果为了判断组间样本总体差异和组内样本变异度,对代谢组学数据进行主成分分析(principal com鄄ponent analysis,PCA),见图 2。第一主成分 PC1 和第二 主 成 分 PC2 的 解 释 率 分 别 为 62郾 73%和9郾 53%,提示正常和枯水血橙组样本存在明显差异图 2(a)。组内样本的皮尔逊相关系数均大于0郾 95,提 示 重 复 样 本 间 相 关 性 强,变 异 小图 2(b)。这些数据表明代谢组学的数据可信度高,可用于后续分析。广泛靶向代谢组学从血橙汁胞中共鉴定到480 种初生代谢物。这些代谢物质可分为 11 类,包
21、括 110 种氨基酸及其衍生物、93 种有机酸、76种糖及醇类、60 种游离脂肪酸、55 种核苷酸及其衍生物、29 种溶血磷脂酰胆碱、21 种维生素、23 种溶血磷脂酰乙醇胺、9 种甘油酯、3 种鞘脂及 1 种磷脂酰胆碱。77第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张皓月等:基于广泛靶向代谢组学的血橙枯水时柠檬酸降解途径研究图1摇 三峡库区血橙采前阶段的气温变化和果实枯水表型Fig.1摇 Temperature variation of blood orange preharvest in Three Gorges Reservoir area andphenotype of fr
22、uit affected by segment dryingN 表示正常汁胞样本,VC 表示枯水汁胞样本,mix 表示质控样本。图 2摇 血橙正常和枯水样本的主成分分析Fig.2摇 Principal component analysis of normal and segment drying samples of blood orange摇2郾 2郾 2摇 代谢物质的定量分析结果代谢物质的定量分析结果见图 3。广泛靶向代谢组学共鉴定了 193 种代谢物质在血橙枯水时差异积累图 3(a)。其中,165 种上调,28 种下调。差异代谢物质的聚类结果显示,脂类和氨基酸等多类物质含量在枯水时上调图
23、 3(b)。将差异代谢物质与 KEGG(kyoto encyclopedia of genesand genomes)数据库比对,用 KOBAS(KEGG or鄄thology based annotation system)分析差异代谢途径。结果发现,亚油酸代谢通路是唯一的显著富集通路(P 0郾 05)图 3(c)。进一步对亚油酸代谢相关脂类物质的组成及枯水时的含量变化特征进行分析,66 种脂类代谢物质在枯水时都显著富集,包括 39 种游离脂肪酸、11 种溶血磷脂酰胆碱、9 种溶血磷脂酰乙醇胺、6 种甘油酯和 1 种鞘脂。这些结果表明,亚油酸代谢可能是血橙枯水时汁胞代谢物质变化的主要特征。亚
24、油酸合成是柑橘果实柠檬酸降解关键途径 乙酰辅酶 A 合成途径的主要部分,说明该途径是血橙果实枯水时柠檬酸降解的主要途径。87食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月Z 得分表示差异代谢物相对含量归一化处理后的数值,反映含量的高低(红色为高含量,绿色为低含量)。N 表示正常汁胞样本,VC 表示枯水汁胞样本。图 3摇 血橙汁胞枯水时的差异代谢物分析Fig.3摇 Differential metabolite analysis in juice vesicles of blood orange during segment drying
25、摇2郾 2郾 3摇 柠檬酸降解途径相关代谢物质的含量变化为系统了解血橙枯水时柠檬酸的消耗机制,本研究对代谢组学揭示的柠檬酸降解相关代谢物质进行了深入挖掘。血橙汁胞枯水时柠檬酸降解途径相关代谢物质的变化见图 4。血橙枯水时,柠檬酸含量下降了 53郾 1%(P 0郾 05)图 4(a)。乙酰辅酶A 合成途径是通过将柠檬酸裂解生成乙酰辅酶 A,再参与合成亚油酸、氨基酸及次生代谢物质。枯水时,亚油酸及脂类物质含量显著上调(P 0郾 05)图 4(b),丝 氨 酸 含 量 显 著 上 调(P 0郾 05)图 4(c)。结果证实乙酰辅酶 A 合成途径是血橙枯水时降酸的主要途径。异柠檬酸、琢鄄酮戊二酸和琥珀
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基于 广泛 靶向 代谢 枯水 柠檬酸 降解 途径 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。